線粒體抗氧化在老年大鼠心肌預(yù)處理早期保護(hù)中作用機(jī)制的研究.pdf

1、心血管疾病發(fā)病率高，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，臨床上保護(hù)心肌的方法主要有：改善心肌灌注液成分、灌注方法、灌注溫度、缺血預(yù)處理、藥物預(yù)處理等。很多實(shí)驗(yàn)室行之有效的心肌保護(hù)方法轉(zhuǎn)化到臨床使用時卻缺乏療效。有關(guān)臨床心肌保護(hù)方法的研究多數(shù)是在各種健康成年動物的心臟模型上進(jìn)行的，而臨床病例卻經(jīng)常復(fù)合多種疾病和情況，“老齡”就是其中一個重要的影響因素。
　　由于老年心肌與成年心肌在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上的差異，同一種心肌保護(hù)措施在成年與老年表現(xiàn)出的

2、效果卻不相同。老年心肌對缺血再灌注（ischemia reperfusion，I/R）存在著易損傷傾向，目前臨床應(yīng)用的心肌保護(hù)技術(shù)均被證實(shí)是不完善的，因此研究老年心肌保護(hù)防治策略有重要的理論意義和實(shí)用價值。
　　1986年Murry等首次提出缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IPC），它是指反復(fù)短暫的缺血和再灌注可以提高組織對隨后一個較長時間缺血缺氧的耐受性。藥物預(yù)處理（pharmacology per

3、conditioning，PPC）的方法，是根據(jù)IPC機(jī)理，通過藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)而呈現(xiàn)減弱I/R損傷的方法。Kerstion等提出吸入麻醉藥預(yù)處理（anesthetic preconditioning，APC）和IPC一樣，早期保護(hù)作用于預(yù)處理后立即出現(xiàn)1～3h后消失（第一窗），24h后出現(xiàn)第二窗保護(hù)作用（延遲時相）并可持續(xù)72h。本研究主要涉及預(yù)處理后第一窗保護(hù)作用。
　　我們選取老年大鼠為對象，利用大鼠心肌I/R模

4、型和成年大鼠心肌細(xì)胞模型，研究和比較預(yù)處理早期成年和老年大鼠心肌保護(hù)機(jī)制的不同特點(diǎn)。通過檢測Akt/GSK-3β信號通路的活性和線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）主要組成成分蛋白的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)老年心肌預(yù)處理保護(hù)功能障礙與線粒體mPTP主要成分親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，Cyp-D）表達(dá)的增高有關(guān)。并通過線粒體抗氧化處理降低了老年大鼠心肌

5、Cyp-D的表達(dá)，改善了老年大鼠預(yù)處理心肌保護(hù)作用。我們相信該機(jī)制是老年大鼠心肌易損性高的重要成因，為臨床老年心肌保護(hù)提供新思路和潛在治療靶點(diǎn)，可橫向推廣到其他相關(guān)疾病防治中。
　　第一部分、老年大鼠心肌預(yù)處理早期保護(hù)功能障礙和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制有關(guān)。
　　長期氧化應(yīng)激壓力使老年心肌在形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能和代謝等方面均不同于成年心肌，如逐漸加重的左心室肥厚、慢性心力衰竭、房顫。老年病人心肌在I/R和體外循環(huán)時更容易受損傷，適用于年輕心

6、肌保護(hù)方法并不能完全適用于老年心肌。
　　目的：調(diào)查成年大鼠和老年大鼠預(yù)處理后心肌信使 RNA（mRNA）表達(dá)的變化，驗(yàn)證預(yù)處理的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　方法：采用大鼠心肌I/R模型，檢測心肌梗死面積和氧自由基（Reactive oxygen species, ROS）含量。通過基因芯片技術(shù)檢測mRNA表達(dá)的變化，并運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)證實(shí)mRNA的變化。
　　結(jié)果：老年大鼠APC后第一窗沒有心肌保護(hù)功能，

7、APC后成年大鼠心肌ROS含量增高，而老年大鼠ROS沒有增高。IPC后成年大鼠心肌Atf3、Egr1、IL6和Ccl2等mRNA表達(dá)增加，但是IPC后老年大鼠心肌mRNA沒有明顯改變，且APC對成年和老年大鼠心肌mRNA也無明顯改變。
　　結(jié)論：老年大鼠吸入麻醉藥預(yù)處理心肌保護(hù)功能障礙和異氟烷未能引出信號ROS的增高有關(guān)，參與預(yù)處理心肌保護(hù)作用涉及到轉(zhuǎn)錄后步驟。
　　第二部分、Akt/GSKβ信號通路調(diào)控線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道

8、在老年大鼠預(yù)處理早期心肌保護(hù)中的作用。
　　線粒體是心肌I/R損傷的重要靶細(xì)胞器，mPTP是介導(dǎo)線粒體損傷的關(guān)鍵因素。Akt/GSK-3β信號通路在心肌保護(hù)中有重要作用，pGSK-3β通過與 ANT的結(jié)合抑制mPTP的開放，起到保護(hù)線粒體和維持細(xì)胞功能穩(wěn)定的作用。
　　目的：老年大鼠心肌預(yù)處理后Akt/GSK-3β信號通路的變化特點(diǎn)；是否能通過調(diào)節(jié)Akt/GSK-3β信號通路，改善老年大鼠心肌保護(hù)作用；Akt/GSK-3β信

9、號通路和mPTP的作用機(jī)制。
　　方法：采用電鏡比較成年和老年大鼠心肌 I/R損傷后線粒體超微結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)，激光共聚焦顯微測定mPTP開放時間。免疫印跡檢測Akt/GSK-3β信號通路活性和mPTP成分變化。運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)研究GSK-3β和mPTP各構(gòu)成蛋白之間的結(jié)合率變化。
　　結(jié)果：成年大鼠在預(yù)處理后Akt/GSK-3β信號通路活化，線粒體水腫和腫脹減少，心肌得到保護(hù)。而基礎(chǔ)狀態(tài)老年大鼠該通路較成年大鼠活性增高，預(yù)處

10、理不能進(jìn)一步激活該通路。老年大鼠分布于線粒體的pGSK-3β增多，與mPTP主要成分蛋白ANT結(jié)合增多，但由于老年大鼠心肌Cyp-D表達(dá)增高且易于和ANT結(jié)合，故mPTP開放時間較成年大鼠縮短。
　　結(jié)論：老年大鼠Akt/GSK-3β信號通路在生理狀態(tài)已經(jīng)被激活，預(yù)處理不能進(jìn)一步激活該信號通路；且老年大鼠心肌線粒體Cyp-D表達(dá)增高，mPTP開放閾值降低，這些可能與老年心肌預(yù)處理功能失調(diào)有關(guān)。
　　第三部分、線粒體抗氧化通過

11、保護(hù)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔道使老年大鼠獲得預(yù)處理早期心肌保護(hù)作用。
　　抗氧化治療被廣泛應(yīng)用于臨床治療，但效果并不理想。重要的原因是很多抗氧化劑不能穿透細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化效應(yīng)。TEMPOL是一種新型膜通透性的兩性電解質(zhì)，和線粒體膜有高度親和力，進(jìn)入線粒體后發(fā)揮SOD擬態(tài)作用。
　　目的：對老年大鼠進(jìn)行線粒體抗氧化處理，觀測心肌和線粒體功能的改善，并探討其可以機(jī)制。
　　方法：線粒體抗氧化處理采取腹腔注射TEMPOL

12、125mg/kg/天，采用I/R模型觀測心肌梗死面積，并驗(yàn)證預(yù)處理心肌保護(hù)作用。試劑盒測定GSH/GSSG，SOD活性，線粒體Ca2+攝取率驗(yàn)證老年大鼠心肌易損性的變化。并用激光共聚焦顯微鏡測定mPTP開放時間的變化。
　　結(jié)果：4周線粒體抗氧化后，GSH/GSSG和SOD活性都明顯增高，免疫印跡顯示MnSOD表達(dá)增高，且Nitrotyosine的蛋白表達(dá)量下降。線粒體Ca2+攝取率恢復(fù)正常，mPTP開放時間延長，老年大鼠預(yù)處理早