CTMP在七氟醚預(yù)處理神經(jīng)保護(hù)中的作用機(jī)制研究.pdf

1、缺血性腦卒中是人類的第二大死因[1],而目前唯一被FDA批準(zhǔn)的外源性輸入tPA溶栓,因治療時(shí)間窗窄、副作用多,僅對(duì)5％的腦卒中患者顯示出確切療效[2]。預(yù)處理可激活多種內(nèi)源性信號(hào),誘導(dǎo)缺血耐受。以預(yù)處理為手段,明確內(nèi)源性保護(hù)信號(hào)的關(guān)鍵分子,將為臨床腦保護(hù)策略研究提供切實(shí)可行的新靶點(diǎn)。我科以往的研究發(fā)現(xiàn):七氟醚預(yù)處理可誘導(dǎo)腦缺血耐受[3,4],然而,七氟醚預(yù)處理的機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。腦缺血損傷后,各種損傷因子如興奮性氨基酸等大量增加。為了存活,

2、機(jī)體同時(shí)會(huì)激發(fā)一系列的保護(hù)機(jī)制,其中內(nèi)源性生存信號(hào)通路是最重要的一個(gè)方面。包括缺血預(yù)處理等諸多神經(jīng)保護(hù)策略,也涉及到生存信號(hào)Akt的激活[5-7]。但是,在缺血狀態(tài)下,Akt激酶的磷酸化水平雖然也會(huì)增加,神經(jīng)元卻依舊凋亡、壞死——機(jī)體本身所活化的Akt通路沒能顯示出任何的促生存作用[8,9]。這一現(xiàn)象提示:在缺血損傷狀態(tài)下,可能同時(shí)伴有某些負(fù)性調(diào)控因子激增,致使 Akt激酶雖有改變而無活性。2009年Nature Neuroscienc

3、e上的一篇研究顯示:負(fù)性調(diào)控因子carboxy-terminal modulator protein(CTMP)在腦缺血損傷后大量增加[10]。由此,我們推測(cè):七氟醚預(yù)處理通過調(diào)節(jié)CTMP的表達(dá)水平,可以恢復(fù)Akt激酶活性,從而誘導(dǎo)腦缺血耐受。
　　本研究旨在揭示 CTMP在七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受中的關(guān)鍵地位及其具體作用機(jī)制,為闡明七氟醚預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受提供新的學(xué)術(shù)見解,為臨床圍術(shù)期腦保護(hù)策略研究提供新的方向。
　　

4、實(shí)驗(yàn)一七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用
　　方法:由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的清潔級(jí)雄性40只 SD大鼠(200到250 g),經(jīng)過一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)分為5組Sham組、I/R(ischemia/reperfusion)24h組、PC+I/R(sevoflurane preconditioning+ischemia/reperfusion)24h組、I/R7d組和PC+I/R7d組(Sham=4,其余n=

5、9)。除假手術(shù)組(Sham)動(dòng)物外,所有動(dòng)物均行局灶性腦缺血再灌注損傷(middle cerebral artery occlusion,MCAO模型),缺血時(shí)間為1h,再灌注24h或7d。其中,給予七氟醚預(yù)處理的動(dòng)物(PC+I/R24h組及PC+I/R7d組),在缺血前1h給予2.7%的七氟醚預(yù)處理45min。Sham組動(dòng)物實(shí)施同樣的各項(xiàng)操作,但不誘導(dǎo)腦缺血再灌注損傷,手術(shù)操作前1h給予45min純氧。分別于再灌注24h和7d觀察神經(jīng)

6、功能學(xué)評(píng)分(NBS)。評(píng)分后,處死動(dòng)物,取腦,行TTC染色,計(jì)算腦梗死容積百分比。
　　結(jié)果:單次七氟醚預(yù)處理可顯著改善缺血后1d、7d時(shí)腦梗死容積百分比,對(duì)1d后的神經(jīng)行為學(xué)亦有改善作用。
　　實(shí)驗(yàn)二 PI3K/Akt信號(hào)通路參與到七氟醚預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用之中
　　方法:由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的清潔級(jí)雄性85只 SD大鼠(200到250 g),經(jīng)過一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)分為9組(Sham=5,其余n=10)

7、:Sham組, I/R組,PC+I/R,WT+PC+I/R(wortmannin,WT)組,LY+PC+I/R(LY294002,LY)組,WT+I/R組,LY+I/R組,VE-WT+PC+I/R組和 VE-LY+PC+I/R組(兩組溶劑對(duì)照組,Vehicle,VE)。除假手術(shù)組(Sham)動(dòng)物外,所有動(dòng)物均行局灶性腦缺血再灌注損傷(MCAO模型),缺血時(shí)間為1h,再灌注24h。其中,給予七氟醚預(yù)處理的動(dòng)物,即:PC+I/R組,WT+P

8、C+I/R組,LY+PC+I/R組,VE-WT+PC+I/R組和VE-LY+PC+I/R組,在缺血前1h給予2.7%的七氟醚預(yù)處理45min。Sham組動(dòng)物實(shí)施同樣的各項(xiàng)操作,但不誘導(dǎo)腦缺血再灌注損傷,手術(shù)操作前1h給予45min純氧。抑制劑WT或LY294002于缺血前10min給予。神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死容積染色于再灌注24h后實(shí)施。
　　結(jié)果:Akt信號(hào)通路的兩種抑制劑均可減少七氟醚預(yù)處理的于再灌注24h后的神經(jīng)保護(hù)效果。

9、r>　　實(shí)驗(yàn)三七氟醚預(yù)處理可抑制CTMP激增,提高Akt激酶活性
　　方法:65只SD大鼠(200到250 g),經(jīng)過一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)分為Sham組,I/R組,PC組(單純預(yù)處理組)和PC+I/R組。I/R組動(dòng)物行局灶性腦缺血再灌注損傷,缺血時(shí)間為1h,再灌注24h。PC組和PC+I/R組動(dòng)物,給予2.7%的七氟醚預(yù)處理45min。PC+I/R組動(dòng)物預(yù)處理后1h行MCAO模型。Sham組動(dòng)物實(shí)施同樣的各項(xiàng)操作,但不誘導(dǎo)腦缺血

10、再灌注損傷,手術(shù)操作前1h給予45min純氧。PC組,I/R組和PC+I/R組動(dòng)物分別于再灌注1h,3h,12h和24h后取皮層半暗帶。以Western Blot方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn):Akt在Ser473位點(diǎn)磷酸化(pSer473-Akt)水平、其下游直接作用分子GSK3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化(pSer9-GSK3β)水平以及Akt內(nèi)源性抑制劑CTMP的表達(dá)水平。另取16只雄性SD大鼠,應(yīng)用試劑盒分別檢測(cè)Sham組,I/R組, PC組及

11、PC+IR組于再灌注3h及相應(yīng)的預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)缺血半暗帶或相應(yīng)部位組織內(nèi)Akt激酶活性。
　　結(jié)果:與Sham組相比,再灌注3h后 I/R組,PC組及PC+I/R組的pSer473-Akt水平均顯著增加,但pSer9-GSK3β只有在PC組及PC+I/R組增加。I/R組CTMP水平在持續(xù)增高至再灌注24h,而I/R組內(nèi)Akt激酶活性與Sham組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與I/R組相比,預(yù)處理可降低過量增加的pSer-473Akt,但可提高pS

12、er9-GSK3β的表達(dá)水平。PC+I/R組CTMP水平較I/R組明顯降低并維持至再灌注24h,Akt激酶活性增高。
　　實(shí)驗(yàn)四 CTMP過表達(dá)可抑制七氟醚預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)效果
　　方法:84只SD大鼠(200到250 g),經(jīng)過一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后,通過慢病毒轉(zhuǎn)染(lentiviral transduction,LV)方法,于預(yù)處理前3d,經(jīng)側(cè)腦室分別注射 LV-CTMP或其亂序?qū)φ誏V-C。72h后,分析Sham組、LV-C

13、TMP組與LV-C組(n=4)大鼠腦內(nèi)CTMP的表達(dá)狀況,及Akt激酶功能活性。另取一批動(dòng)物,按實(shí)驗(yàn)一的方案,于再灌注24h后,對(duì)Sham組、LV-CTMP組、LV-C組、I/R組、PC+I/R組、LV-CTMP+PC+I/R組、LV-C+PC+I/R組、LV-CTMP+I/R組和LV-C+I/R組(n=8)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分。Sham組、I/R組、PC+I/R組、LV-CTMP+PC+I/R組、LV-C+PC+I/R組、LV-CT