脊髓內源性大麻素含量升高可激活星形膠質細胞并參與神經(jīng)病理性痛覺超敏的發(fā)生.pdf

1、生理狀態(tài)下，人們對能引起潛在組織損傷的刺激產(chǎn)生疼痛反應，這對維持機體完整、保證身體健康至關重要。但是，自發(fā)性疼痛或對不恰當?shù)拇碳ぎa(chǎn)生持續(xù)性的疼痛（慢性疼痛）則會嚴重影響人類的生活質量。據(jù)美國科學院醫(yī)學研究所報道，慢性疼痛的發(fā)病率已超過心血管疾病、糖尿病和癌癥的發(fā)病率，成為天下第一大病。作為最常見、最頑固、最難治的慢性疼痛，神經(jīng)病理性疼痛因其高發(fā)病率、高致殘率已經(jīng)引起人們的密切關注。闡明神經(jīng)病理性疼痛神經(jīng)學機制以及尋求有效的治療手段，是當

2、今醫(yī)學界亟待攻克的重大課題。
　　神經(jīng)病理性疼痛是以自發(fā)性疼痛(spontaneous pain)、痛覺過敏(hyperagesia)及痛覺超敏（allodynia)為主要臨床特征[1]。內源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system，ECS)主要由內源性大麻素(endocannabinoids, eCBs)(如AEA、2-AG、OEA等)、作用受體(CB1、CB2、TRPV1等)以及大麻素代謝酶(FAAH、MAG

3、L等)組成[2]。以往研究多報導了內源性大麻素系統(tǒng)在痛覺通路中的鎮(zhèn)痛作用[3-6]，近年來的一些研究提示其可能通過抑制抑制性中間神經(jīng)元的功能而發(fā)揮致痛作用[7-10]。Starowicz and Przewlocka推測，神經(jīng)損傷后脊髓背角eCBs的含量升高，以某種形式促進神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生[11]。
　　脊髓星形膠質細胞在慢性疼痛包括炎癥痛、神經(jīng)病理性痛和癌癥痛等的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[12,13]。已證實星形膠質細胞上存

4、在CB1受體，其可被神經(jīng)元釋放的eCBs激活，引起星形膠質細胞釋放谷氨酸,進而激活神經(jīng)元突觸外NMDA受體[14]。外源性大麻素（exogenous cannabinoids）也可激活星形膠質細胞CB1受體，引起谷氨酸釋放[15]。
　　本研究擬運用動物行為學、免疫熒光染色等技術，探討脊髓內源性大麻素含量升高是否會激活星形膠質細胞并參與神經(jīng)病理性痛覺超敏的形成，為進一步研究神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。
　　第一部分

5、：內源性大麻素受體CB1與脊髓背角星形膠質細胞的共定位
　　目的：
　　觀察脊髓背角的星形膠質細胞上是否表達內源性大麻素受體CB1。
　　方法：
　　選用SPF級雄性C57BL/6小鼠4只，麻醉后先用PBS沖凈血液，隨即灌入多聚甲醛。取脊髓腰膨大段后固定、蔗糖梯度脫水、冰凍切片后，每只小鼠隨機挑取3片脊髓片行GFAP/CB1免疫熒光雙標，觀察脊髓背角處二者的共標情況。
　　結果：
　　脊髓背角處的星形

6、膠質細胞上表達內源性大麻素受體CB1。
　　第二部分：升高鞘內大麻素水平對實驗大鼠機械性縮足閾值的影響
　　目的：
　　觀察鞘內大麻素含量升高后實驗大鼠疼痛行為的變化。
　　方法：
　　選用SD雄性大鼠36只，隨機分為2-AG組（n=6）、乙腈對照組（n=6）；CP55940組（n=6）、DMSO溶劑對照組（n=6）；JZL195組（n=6）、DMSO溶劑對照組（n=6）。全部行鞘內置管術。利多卡因試驗后取

7、造模成功動物進行鞘內給藥。分別在給藥后第1、3、5、7、14、21 d測量實驗大鼠機械性縮足反射閾值。
　　結果：
　　與各自溶劑對照組相比，鞘內注射大麻素2-AG、大麻素受體激動劑CP55940、大麻素水解酶抑制劑JZL195后可在第1 d產(chǎn)生明顯痛覺超敏（P＜0.01）并至少持續(xù)到給藥后第21 d（P＜0.001）。
　　第三部分：升高鞘內大麻素水平對脊髓背角星形膠質細胞的影響
　　目的：
　　觀察鞘內

8、大麻素含量升高后，實驗大鼠脊髓背角處星形膠質細胞的激活狀態(tài)。
　　方法：
　　選用75只SD大鼠，隨機選取21只為2-AG實驗組、21只為CP55940實驗組、21只為JZL195實驗組，剩余每組3只作為相應的溶劑對照組。全部行鞘內置管術，利多卡因試驗后取造模成功動物進行鞘內給藥。分別在給藥后第1、3、5、7、14、21 d取大鼠脊髓腰膨大，后固定、脫水、冰凍切片后，每組三只、每只大鼠隨機挑取3片脊髓片行GFAP免疫熒光單標

9、，觀察脊髓背角處星形膠質細胞激活情況。
　　結果：
　　與各自溶劑對照組相比，鞘內注射大麻素2-AG、大麻素受體激動劑CP55940、大麻素水解酶抑制劑JZL195后可在第3 d開始激活星形膠質細胞（P＜0.05）并至少持續(xù)到給藥后第21 d（P＜0.01）。
　　第四部分：敲除星形膠質細胞上的CB1受體對實驗小鼠疼痛行為及脊髓背角星形膠質細胞的影響
　　目的：
　　觀察敲除星形膠質細胞上的CB1受體后，神

10、經(jīng)損傷后實驗小鼠機械性縮足閾值的變化以及脊髓背角處星形膠質細胞的激活狀態(tài)。
　　方法：
　　選用雄性GFAP-CB1-KO小鼠、GFAP-CB1-WT小鼠各9只。隨機選出3只KO小鼠、3只WT小鼠取脊髓，免疫熒光組織化學染色備用。剩余12只全部行坐骨神經(jīng)結扎術（CCI模型）。術后第7 d行為學檢測完后隨機抽取3只KO小鼠、3只WT小鼠取脊髓，免疫熒光組織化學染色備用。術后第14 d行為學檢測完后剩余3只KO小鼠、3只WT小鼠

11、取脊髓，免疫熒光組織化學染色備用。
　　結果：
　　與WT+CCI小鼠相比，敲除星形膠質細胞上CB1受體的小鼠在神經(jīng)損傷后未形成明顯痛覺超敏（P＜0.001）；同時，其脊髓背角處星形膠質細胞的激活也明顯減少（P＜0.01）。
　　小結：
　　1.脊髓背角處的星形膠質細胞上表達大麻素受體CB1。
　　2.升高鞘內大麻素水平可導致實驗大鼠產(chǎn)生痛覺超敏。
　　3.升高鞘內大麻素水平可明顯激活脊髓背角處星形膠