星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP釋放機(jī)制及其相應(yīng)受體在神經(jīng)病理性疼痛中的作用.pdf

1、以往觀點(diǎn)認(rèn)為,神經(jīng)元—神經(jīng)元間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮功能的唯一途徑,而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等)僅被視為是神經(jīng)元的被動(dòng)的、輔助性的伙伴。近年人們對星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能有了新的認(rèn)識(shí)。星形膠質(zhì)細(xì)胞除了營養(yǎng)支持的功能外,還可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元間化學(xué)突觸的信息傳遞及調(diào)控腦內(nèi)神經(jīng)血管舒張-收縮藕合。此外,它可與神經(jīng)元形成“三成份突觸”直接參與信息交流。特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放類似于神經(jīng)遞質(zhì)的“膠質(zhì)遞質(zhì)”以主動(dòng)響應(yīng)外界的刺

2、激。這些膠質(zhì)遞質(zhì)包括谷氨酸、三磷酸腺苷(ATP)等小分子物質(zhì),它們不但參與了突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)機(jī)制,成為學(xué)習(xí)記憶的基本要素,也參與了腦血流量調(diào)控、神經(jīng)創(chuàng)傷、神經(jīng)病理性疼痛等生理和病理過程。但這些膠質(zhì)遞質(zhì)的釋放機(jī)制仍不清楚。目前研究認(rèn)為,在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),谷氨酸的釋放是以鈣離子依賴的“Kiss-and-run”模式為主的量子化釋放;而ATP的量子化釋放假說雖也得到一些間接的證據(jù)支持,但在生理?xiàng)l件下ATP的釋放機(jī)制仍不確定。因此,

3、本論文的第一部分將著重探討星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP的釋放機(jī)制。作為神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞間信息交流的活躍信號分子之一,ATP還是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一類重要的傳遞傷害性信息的信號分子,參與痛信號的形成、傳遞以及膠質(zhì)細(xì)胞的活化。當(dāng)前有關(guān)神經(jīng)病理性疼痛的新觀點(diǎn)認(rèn)為,除神經(jīng)元的作用以外,膠質(zhì)細(xì)胞(包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞)的活化非常關(guān)鍵。神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速出現(xiàn)明顯的募集與活化,星形膠質(zhì)細(xì)胞也出現(xiàn)類似變化,但相對出現(xiàn)較晚而且發(fā)展較慢。而不同膠質(zhì)細(xì)胞間如此復(fù)

4、雜而又精確的激活時(shí)間譜(temporal pattern)有賴于神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞間、膠質(zhì)細(xì)胞-膠質(zhì)細(xì)胞間完美的協(xié)調(diào)與整合,但其間的協(xié)調(diào)信號尚不清楚。ATP的相關(guān)受體廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),已有證據(jù)表明P2X4和P2X7受體在神經(jīng)病理性疼痛中起了重要作用,但仍有很多問題需要進(jìn)一步明確:例如這些受體在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上是持續(xù)存在還是疼痛時(shí)暫時(shí)性出現(xiàn)?它們在小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)變化與神經(jīng)病理性疼痛不同的時(shí)相有何關(guān)系?為此,我們研究了

5、在神經(jīng)病理性疼痛不同時(shí)間點(diǎn)(建模后10、20、30天)上脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及其上P2X4、P2X7受體亞型間的動(dòng)態(tài)關(guān)系。在本論文的第二部分,我們提供了星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞激活,P2X4,P2X7受體表達(dá)與神經(jīng)病理性疼痛的時(shí)程關(guān)系提供了系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)資料及其分析。第一部分生理刺激誘發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ATP的釋放機(jī)制研究
　　【目的】：通過對刺激誘發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP和谷氨酸釋放動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)及相關(guān)調(diào)節(jié)因素的對比研究,探

6、討星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP釋放的機(jī)制。
　　【方法】：(1)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞取自出生24小時(shí)以內(nèi)的Sprague-Dawley大鼠的海馬,培養(yǎng)14-20天,經(jīng)細(xì)胞純化后使用;(2)將谷氨酸AMPA受體GluR1和GluR2(flip)亞型的全長質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293A細(xì)胞制備谷氨酸嗅探細(xì)胞(Glu-sniffer);將ATP離子型受體P2X4亞型的全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293A細(xì)胞,制備ATP嗅探細(xì)胞(ATP-sniffer);檢測其

7、特異性和靈敏度;(3)利用嗅探細(xì)胞膜片鉗技術(shù)(sniff-patch)比較了星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP、谷氨酸的釋放信號的動(dòng)力學(xué)及星形膠質(zhì)細(xì)胞與大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞(RACC)ATP釋放動(dòng)力學(xué)的差別;(4)使用微碳纖維電極(proCFE),利用電化學(xué)方法測量兒茶酚胺類物質(zhì)從多巴胺負(fù)載的星形膠質(zhì)細(xì)胞及大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞(RACC)中的量子化釋放的動(dòng)力學(xué);(5)利用雙光子顯微鏡觀察刺激誘發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中FM染料的量子化釋放過程;(6)利用鈣成像系統(tǒng)

8、(鈣離子探針為Fura-2 AM)或激光共聚焦顯微鏡(鈣離子探針為Fluo-4 AM或Rhod-2 AM)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的實(shí)時(shí)變化;(7)利用RT-PCR方法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的P2X7受體及常見的牽張敏感通道的mRNA水平;(8)利用藥理學(xué)方法,篩查可能與ATP釋放相關(guān)的分子;(9)利用特異針對大鼠P2X7受體的shRNA慢病毒顆粒獲取顯著降低P2X7受體水平的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞并與原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn);(10)使用蛋

9、白質(zhì)印跡法測定目的蛋白的表達(dá)水平;使用免疫熒光技術(shù)分析目的蛋白的分布情況。
　　【結(jié)果】：“Sniff-patch”技術(shù)具有對單個(gè)囊泡釋放事件的時(shí)空分辨能力。利用這一技術(shù),我們確定在模擬生理?xiàng)l件下的牽張刺激時(shí)所觸發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放ATP和谷氨酸的動(dòng)力學(xué)是截然不同的:谷氨酸是以量子化的途徑釋放,而ATP是以非量子化途徑釋放。(1)谷氨酸的釋放是鈣離子依賴性的,而ATP的釋放是非鈣離子依賴性的;(2)破壞膠質(zhì)細(xì)胞的溶酶體可以阻斷膠質(zhì)

10、細(xì)胞內(nèi)鈣離子依賴性的谷氨酸量子化釋放,而不影響ATP的釋放;(3)阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體的功能將消除牽張刺激誘發(fā)的ATP的釋放;(4)使用P2X7受體的阻斷劑或使用RNAi技術(shù)降低P2X7受體的表達(dá)將顯著抑制牽張刺激所誘發(fā)ATP的釋放。
　　【結(jié)論】：在類似生理?xiàng)l件的刺激下,星形膠質(zhì)細(xì)胞可以同時(shí)釋放ATP和谷氨酸,但其釋放的機(jī)制各不相同:谷氨酸是通過鈣離子依賴的胞吐途徑進(jìn)行量子化釋放,而ATP則是通過非鈣離子依賴的P2X7受體通道

11、進(jìn)行非量子化釋放。
　　第二部分脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞及其ATP受體P2X4和P2X7亞型在神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)病理性疼痛中的時(shí)空間動(dòng)態(tài)變化與作用的研究
　　【目的】：通過觀察、比較脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞激活的時(shí)空間分布模式及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性P2X4和P2X7受體表達(dá)的時(shí)空間模式與神經(jīng)損傷后出現(xiàn)的異常性觸痛時(shí)程上的異同點(diǎn),探討神經(jīng)病理性疼痛不同時(shí)相分別與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞間、P2X4、P2X7受體間的動(dòng)態(tài)關(guān)系。

12、>　　【方法】：(1)使用成年SD大鼠坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(spared nerve injury,SNI)模型;(2)測量SNI模型大鼠每一時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后0、10、20、30天)機(jī)械刺激縮足反應(yīng)閾值(PWMT)(;3)用蛋白質(zhì)印跡法檢測每一時(shí)間點(diǎn)P2X4和P2X7受體的表達(dá)水平;(4)用雙重免疫熒光染色技術(shù)分析每一時(shí)間點(diǎn)P2X4和P2X7受體及星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)和分布;(5)用雙重免疫電鏡染色技術(shù)觀察P2X4和P2X7

13、受體的超微結(jié)構(gòu)定位;(6)用藥理學(xué)的方法評估P2X4、P2X7受體及活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞在異常性觸痛中的作用。
　　【結(jié)果】：(1)SNI手術(shù)后,脊髓背角內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活高峰期早于星形膠質(zhì)細(xì)胞,在SNI初期,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞主要分布在脊髓背角淺層,隨時(shí)間發(fā)展,脊髓背角深層逐漸出現(xiàn)激活態(tài)的膠質(zhì)細(xì)胞;(2)SNI術(shù)后,小膠質(zhì)細(xì)胞的P2X4和P2X7受體均表現(xiàn)上調(diào),但反應(yīng)高峰期不同:P2X7受體(術(shù)后10天)早

14、于P2X4受體(術(shù)后20天);(3)SNI術(shù)后,星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)僅表現(xiàn)為P2X7受體的持續(xù)表達(dá)上調(diào),在本實(shí)驗(yàn)中,高峰出現(xiàn)在術(shù)后30天;(4)免疫電鏡分析顯示神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞均有P2X4、P2X7受體分布;在神經(jīng)元P2X4受體多分布于突觸后成份和線粒體的外膜,而P2X7受體主要分布在突觸前成份和線粒體的內(nèi)膜與嵴上;(5)在不同的時(shí)間點(diǎn)使用P2X受體的拮抗劑均可減輕觸痛,但鎮(zhèn)痛效果不同;抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化也可抑制異常性觸痛。
　　【結(jié)論

15、】：以上結(jié)果提示在P2X4受體與P2X7受體之間以及表達(dá)這兩種受體的星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之間存在疼痛信號的交流,P2X4、P2X7受體,星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性疼痛的不同階段發(fā)揮著不同的作用。SNI后的初始階段以P2X4受體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)為主;而SNI后的持續(xù)階段以P2X7受體陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)為主,但P2X4受體陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞也參與其中,對兩者的抑制均可減輕異常性疼痛,說明在維持階段出現(xiàn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠