gpcr-gα融合蛋白及其在ogpcrs配基篩選中的應(yīng)用

1、· 5 1 8·中國藥理 學(xué)通報 C h i n e s eP h a r n u t c o l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 5M a y ； 2 1 ( 5 ) ： 5 1 8 ～ 2 1G P C R ． G 0 【 融合蛋白及其在 o G P C R s 配基篩選中的應(yīng)用 吳芳明， 劉永學(xué) ( 1 ． 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理室， 北京1 0 0 8 5 0 ；

2、 2 ． 江西中醫(yī)學(xué)院中藥系， 江西 南昌3 3 0 0 0 4 )中國圖書分類號 ： R - 0 5 ； R3 4 1 ． 3 ； R3 9 2 ． 11 ； R9 7 7 ． 6文獻(xiàn)標(biāo) 識碼 ： A 文章編號 ： 1 0 0 1 —1 9 7 8 ( 2 0 0 5 ) 0 5 — 0 5 1 8 — 0 4摘要： G P C R — G d融合蛋白是近幾年用于受體研究的新穎手 段 之一 ， 它 的表達(dá)確保 了受體與 G蛋 白之 間

3、 1 ：1 的化學(xué) 計 量關(guān) 系 、 空問位置 七 的鄰近性 及適 宜于 高通量 的配 基篩選 ，使其為孤兒 G蛋 白偶聯(lián)受體提供了一種新的研究策略， 將 在孤 兒受體 的配基 篩選 中 發(fā)揮 重要作 用 ， 對 研 發(fā) 以 o G P C R為作 用靶點的新藥產(chǎn)生積極 意義。關(guān)鍵 詞 ： 孤兒 G蛋 白偶聯(lián)受體 ； G蛋 白； 融合蛋 白； 配基篩選 G P C R — G a融合蛋 白( Gp r o t e i n — c o u

4、 p l e dr e c e p t o r —Ga l p h af u s i o np r o t e i n) 是近 l 0年來逐漸發(fā)展起 來 并用于受體研究的新技術(shù)。該技術(shù)將 G P C R基 因序 列 的 3端和 G基因序列的 5端融合連接 ， 并將融 合基因在體外細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 中表達(dá) ， 再通過制備含 有融合蛋白的膜總蛋白， 進(jìn)一步用于 G蛋白偶聯(lián)受 體 ( Gp r o t e i n — c o u p l e dr

5、 e c e p t o r s ， G P C R s ) 相應(yīng)配基的 篩選及其它研究 。孤 兒 G蛋 白偶聯(lián)受體 ( o r p h a nGp r o t e i n — c o u p l e dr e c e p t o r s ， o G P C R s ) 是一類 配基 及功 收稿 日 期 ： 2 0 0 4— 1 0— 2 2 ， 修回 日 期 ： 2 0 0 4—1 2 — 0 9基金項 目： 國家 自 然科學(xué)基金 資

6、助項 目( N o3 0 1 7 1 0 9 6 ) ； 全軍 醫(yī)藥衛(wèi) 生 “ 十五” 面 E 資助項 目( N o0 1 M B 0 5 6 )作 者簡 介： 吳 芳 明 ( 1 9 8 1 一) ． 男， 碩 士 ， T e l ： 0 1 0 4 5 6 9 3 2 2 5 2 ．E ． m a i l ：w u f a n g m i n g0 _ 0 @ 1 6 3 ． C O r l l ；劉永學(xué)( 1 9 6 6 一) ，

7、 男， 博士， 副研究員， 研究方向： 受體藥 理學(xué) 及新藥藥理 ， 通訊 作者 ， T e l ： 0 1 0 4 5 6 9 3 2 2 5 2 ， Em a i l ： l i ．u y x @ n i e ． b mi ． a e ． c n能均屬未知的受體 ， 是藥物作用的重要潛在靶點 ， 對 其配基的篩選確認(rèn)是新藥研 發(fā)的最關(guān)鍵環(huán)節(jié) ， 也是 導(dǎo)致新藥發(fā)現(xiàn) 的基礎(chǔ)。。顯 然， 要從含有數(shù) 以千 、萬計的化合物庫中篩選 出孤兒

8、受體的特異性配基 ，就必須建立一個高通量 ( h i g h — t h r o u g h p u t ) 的配基篩 選體系。G P C R — G a融合蛋 白作為一個假 陽性反應(yīng) 發(fā)生率極低的高通量篩選體系 ， 為孤兒受體的配基 篩選提供了一條簡便快捷 的途徑 。1G P C R - G o t 融合蛋白1 ． 1G P C R · G o t融合蛋 白的基本 特征 G蛋 白偶 聯(lián)受體 因與 G蛋 白相偶聯(lián) 而得 名。G

9、蛋 白為雜合 三聚體， 由、 B和 ^ y 三個亞單位組成。一般認(rèn)為在 與 G P C R s 相偶聯(lián)的反應(yīng) 中， 以 O t 亞單位介導(dǎo)的作用 為主 ， 由它作用引起產(chǎn)生第二信使 ， 引發(fā)級聯(lián)放大反 應(yīng)， 調(diào)節(jié)下游效應(yīng)器的功能活動 ， 而 p 、 ^ y 亞單 位則 形成穩(wěn)定 的功能性 復(fù)合體起 輔助作用 。隨著受 體研究的 日益深入 ， 對其研究逐漸 由定性 研究 向定 量研究過渡。由于不 同的細(xì)胞體 系 G P C R s 與其相

10、 偶聯(lián)的 G a蛋 白之間的化學(xué)計量 比各不相 同， 因此 ， 在不同的細(xì)胞中 G P C R s 和 G蛋白亞單位的相互 作用的定量分析研究就缺乏一個共 同的衡量標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此 ， 1 9 9 4年 ， B e r t i n 等 首先成功構(gòu)建了共價連 接的 pR — G sO t 融合蛋 白， 由于該融 合蛋 白中 pR和 G sO t 在 化 學(xué) 計 量 上 的 1 ： 1的關(guān) 系 ， 使 之 在 G P C R s 和 G a的相

11、互作用的定量分析研究中發(fā)揮重 要作用。此后 G P C R — G a融合 蛋白在受體中的研究 也 不 斷 深 入。 1 9 9 9 年 ， C o l q u h o u n等 總 結(jié) 出Th ed e v e l o p m e n to ft h er e v e r s a lo ft h et u m o rmu l t i d r u gr e s i s t a n c eDAIC h u n — l i n g ．F U

12、L i ． WU( C a r t c e rC e n t e r ， S u nY a t — s e nU ) f v e r s i t ) ，G u a n g z h o u51 0 0 6 0 ， C h i m t )A b s t r a c t ： Mu l t i d r u gr e s i s t a n c e ( MD R) o ft u m o rc e l l sh a sb e c o met h e

13、ma i ni mp e d i me n tt h a ti n f l u e n c et h ec u r a t i v ee f f e c to fc a n c e rc h e mo t h e r a p y ．Al t h o u g ht h e r ea r ema n yme c h a n i s msc a ng e n e r a t et h emu h i d m gr e —s i s t a n

14、 c e ，t h eo v e r e x p r e s s i o no fP — g l y c o p r o t e i ne n c o d e db yt h em u l t i d r u gr e s i s t a n c e 一 1 ( m d r 1 )g e n ei st h em a i nc a u s ei nt h ef o r ma t i o no fMDR．S e a c h i n gf

15、o ri n n o c u o u sa n de f f e c t i v er e v e r s a l0 fMDRi sn o to n l yame t h o do fi mp r o v i n gt h ee f ic i e n c yo fc a n c e rc h e mo t h e r a p yb u ta l —S Ot h ep r o b l e md e s i d e r a t e dt o

16、b er e s o l v e di nc h e n l o —t h e r a p yd o ma i n ．Ke ywo r d s ： mu l t i d m gr e s i s t a n ( ‘ e；P — g l y c o p r o t e i n：r e —v e r s a l ； t u mo r ； t h e r a p y維普資訊 http://www.cqvip.com · 5 2 0

17、·中國藥理 學(xué)通報 C h i n e s eP h a r m a c o l o g i c a lB u l l e t i n2 0 0 5M a y ； 2 1 ( 5 )2 ． 2 ． 1 原理 當(dāng)前 ， 一般認(rèn)為配基與 G P C R s 結(jié)合 會誘發(fā)后者構(gòu)象 的變化 ， 使 G P C R s 處于活化狀 態(tài)，活化的受體與 G蛋白相互作用 ， 促使 G T P取代 僅亞 單位上所結(jié)合的 G D P ， 僅與 p

18、亞單位解離 ， 形成 G蛋白的活化形式 。在 G P C R s 和 G 僅共 同表達(dá)的完整 細(xì)胞 中， 由于配基調(diào)節(jié) 的 G T P結(jié)合的量非常低 ， 一 般的方法很難檢測 到 G T P結(jié)合的量。而 當(dāng)激動劑 作用在 G P C R ． G融合蛋 白上 時， B e r t i n等 發(fā)現(xiàn) ，由于 G P C R ． G 僅融合蛋 白可以促進(jìn)二者之間更加有 效的偶聯(lián) ， 增加 G T P與活化 了的 G 僅的結(jié) 合的量。因此 ， 當(dāng)

19、用一種放射性元素 s 對 G T P進(jìn)行標(biāo)記 ， 就 可以通過檢測與活化的 G 僅結(jié)合形式的 s ] G T P ~ S的放射性強度 ， 進(jìn)而判 斷受體是否被配 基所激活?；诖?， 進(jìn)行配基篩選時 ， 將化 合物作用 于 G P C R ．G 僅融合蛋白上 ， 通過檢測結(jié) 合形式 的 [s ] G T P ~ S與 G D P的量的變化關(guān)系， 即可判斷該化合物是否為 特異性配基 。2 ． 2 ． 2 方案 在得到 o G P C R

20、s 和 G 僅c D N A的基礎(chǔ) 上 ， 借助 K O D聚合酶 ， 經(jīng)過 P C R的擴(kuò)增反應(yīng)， 表達(dá) 得到大量的含 o G P C R s 基 因序列 3端和 G 僅基 因序 列 5端連接的融合基因， 然后將融合基因與表達(dá)載 體進(jìn)行連接， 并把構(gòu)建載體轉(zhuǎn)至細(xì)胞使之表達(dá) o G ．P C R ． G 僅融合蛋 白， 由于該蛋 白表 達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞 膜 ， 故提取膜蛋 白即可得到 o G P C R ． G 僅融合 蛋 白。為了確定膜

21、制備中是 否含有 o G P C R ． G 僅融合蛋 白，可用 We s t e r n印跡法進(jìn)行鑒定 。然后再進(jìn)行配基篩 選 ， 簡言之 ， 將化合物或組 織提取物與 G P C R ． G 僅融 合蛋白在一定條件下共同孵育 ， 待反應(yīng)完畢 ， 通過檢 測反應(yīng)物中結(jié)合形式 [s ] G T P ~ S與 G D P的數(shù)量 以判斷受體蛋 白是否被檢測物結(jié)合并激活 ， 從而確定 該孤兒受體的配基。目前， 在運用 G P C R — G

22、僅融合蛋 白對 o G P C R s 進(jìn) 行配基篩選的工作中， 以日本學(xué)者 H a g a 所領(lǐng)導(dǎo)的課 題組的研究工作較為突出， 他們將 2 6個 o G P C R s 分 別與 G i 僅及 G s 僅亞單位形成融合蛋 白后 ， 提取膜總 蛋 白， 而后利用含有近10 0 0 個化合物或組織提取物 庫與融合 蛋 白作 用， 通過 檢 測結(jié) 合 形 式 的 [s ]G T P ~ S 的量來進(jìn)行高通量的配基篩選 工作 ， 并在其 中

23、發(fā)現(xiàn)了 l 5個類似于激動劑作用的化合物 、 一個反 向激動劑及 一個 內(nèi)源性 的激動 劑， 這 些工作 對 于o G P C R s 的去孤兒化及新藥發(fā)現(xiàn)工作有著極為重要 的意義， 同時也 說明運用 G P C R — G 僅融 合蛋 白進(jìn)行 配基篩選是切實 可行的。2 ． 2 ． 3 優(yōu)勢與基于培養(yǎng)細(xì)胞的第二信使篩選模 式相 比， 運 用 G P C R ． G 僅融 合蛋 白進(jìn)行配基篩選有 如下優(yōu)勢 ： ①易于得到大量包含融合蛋

24、白的膜制備 ；② s ] G T P ~ S結(jié)合反應(yīng)過程簡單且適宜于高通量 的篩選 ； ③激動劑、 拮抗劑及部分激動劑可以很容易地被區(qū)分開來； ④ 出現(xiàn)假陽性實驗結(jié)果的概率非常 小 ； ⑤信 噪 比更 高 ， 不 容易受 到外 界 因素 的干 擾 l 1； ⑥無需進(jìn)行大量細(xì)胞的培養(yǎng)。3 存在 問題及前景 G P C R ． G 僅融合蛋白提 供 了一個新 的策略去研 究孤兒 G蛋白偶聯(lián)受體 ， 與目前較 為成熟的第二信 使篩選手段互 為

25、補充。當(dāng)然， 由于 G P C R ． G 僅融 合蛋白 自身的一些特點 ， 運 用 G P C R ． G 僅融 合蛋 白進(jìn) 行配基篩 選的 策略也存 在不少 的 問題 和劣 勢 ： ① s ] G T P y S結(jié) 合實驗對 G 僅 q偶聯(lián)受體并不適 用，同時 ， 對與 G 儀 。偶聯(lián) 的受體 ， 只能在完整的細(xì)胞 中觀測到s ] G T P ~ S的結(jié) 合； ② 由于在 G P C R ． G 僅融 合蛋 白中是直接檢測 s ]

26、G T P , y S 的結(jié)合的量 ， 而不 是檢測級聯(lián)放大反應(yīng)所 引起的信號， 所以融合蛋 白系統(tǒng)對配基濃度的敏感性不如以第二信使為檢測指 標(biāo)的完整細(xì)胞研究 ； ③結(jié)合動力學(xué)過程 尚待進(jìn)一 步 闡明。一般來說 ， [s ] G T P ~ S與 G 僅亞單位結(jié)合 的量伴隨著 G D P的濃度升高而降低 。然而， D u p u i s等 在研究 s ] G T P ' y S 與活化的 G 僅亞單位 相結(jié)合的過程中發(fā)現(xiàn)， 部

27、 分受體被活化后 ， 活化型 G 僅亞單位與 s ] G T P y S 結(jié)合的量伴隨著 G D P濃度的 增加下降的程度很不明顯， 使得 s ] G T P ' y S與活化 的 G 僅亞單位之間的結(jié)合動力學(xué)過程不易描述 。這 對基于結(jié)合型[s ] G T P ~ S的量 的變化曲線 為基礎(chǔ) 判斷受體是否被活化的配基篩選研究極其不利。這 些問題亟待解決 在今后將 G P C R — G 僅融合蛋白技 術(shù)應(yīng)用于 o G P C

28、R s 的研究 中， 只要根據(jù)情況充分發(fā) 揮其優(yōu)勢 ， 盡量避免該技術(shù)尚存在的不足， 并注重同其它 已有手段的結(jié)合運用 ， 取長 補短 ， 那么 G P C R ．G 僅融合蛋 白技術(shù)肯定會在 o G P C R s 配基篩選及其 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域的研究 中發(fā)揮重要作用， 因此具有 良好的應(yīng)用前景。參 考文獻(xiàn) ：[ 1 ]劉永學(xué) ， 余少平 孤兒 G蛋白偶聯(lián)受 體及其作為新藥靶點 的重要意義【 J ] ． 中國藥理 學(xué)通報 ． 2 0 0

29、 3 ． 1 9 ( 6 ) ： 6 0 1 — 4 ．[ 2 j呂寶璋． 受體的 概論 [ M ] ／ ／ 呂寶璋 ． 盧 建， 安明榜 主編．受體 學(xué)． 合肥 ： 安徽科學(xué)技 術(shù)出版社 ， 2 0 0 0 ： 3— 2 5 ．3jWu r c hT ，P a u w e l sP J ．An a l y t i c a lp h a r ma c o l o g yo fGp r o t e i n—維普資訊 http://www.