金魚卵黃原蛋白多克隆抗血清的制備及在農(nóng)藥環(huán)境雌激素活性篩選中的應(yīng)用.pdf

1、我國是農(nóng)藥生產(chǎn)、使用大國，20世紀(jì)90年代中期以來每年生產(chǎn)農(nóng)藥50萬t以上，使用量40萬t以上，并成逐年上升趨勢，其中約80％的農(nóng)藥使用后直接進(jìn)入環(huán)境，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。多數(shù)農(nóng)藥不僅對生物具有強(qiáng)的毒性作用，甚至對內(nèi)分泌系統(tǒng)具有擾亂作用。在已確認(rèn)的具有環(huán)境雌激素活性的化學(xué)物質(zhì)中，農(nóng)藥所占比例較大，1999年世界自然基金會報告的125種環(huán)境雌激素中，農(nóng)藥有86種，占68.8％。因此，有必要建立農(nóng)藥環(huán)境雌激素活性的篩選評價體系，以減少其對

2、環(huán)境的危害。目前，國內(nèi)外比較成熟的環(huán)境雌激素篩選評價體系主要包括魚類卵黃蛋白原(vitellogenin，Vtg)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)法、重組基因酵母檢測法和酵母雙雜交法等。其中，雄性魚類Vtg作為檢測環(huán)境雌激素的重要生物標(biāo)志物，已得到廣泛的應(yīng)用。但是Vtg的定性和定量依賴于Vtg抗體的制備。由于不同魚種間Vtg具有較高的種間差異性，因此需要制備不同的抗體測定Vtg。在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中已經(jīng)制備了兔抗金魚多克隆抗血清，為進(jìn)一步提高抗體的特異性，本

3、研究以金魚為模式生物，制備了鼠抗金魚Vtg多克隆抗血清，并用western-blot技術(shù)對8種常用農(nóng)藥的環(huán)境雌激素活性進(jìn)行了篩選。研究結(jié)果表明： 腹腔注射0.05 mg/g(BW)17β-雌二醇(E2)，誘導(dǎo)金魚2周后尾靜脈取血，離心分離得到的血漿，經(jīng)凝膠過濾層析(分子篩)和離子交換兩步法進(jìn)行分離、純化。native-PAGE結(jié)果表明，純化的血漿樣品可被考馬斯亮藍(lán)、糖、磷、脂蛋白同時染色，確定為Vtg，在非變性條件下電泳檢測其

4、分子量約為460 kDa，經(jīng)SDS-PAGE得到分子量分別為130、106、81和54 kDa的4個亞基。 采用純化的金魚Vtg腹腔注射小白鼠進(jìn)行免疫，免疫周期為6周。首次免疫兩周后進(jìn)行第2次免疫，以后每周注射1次，連續(xù)注射3周，每只小白鼠每次注射量均為50μg純化金魚Vtg(等體積抗原與弗氏完全佐劑充分混勻)，于第5次注射后，在1周內(nèi)連續(xù)注射抗原2次以加強(qiáng)免疫效果，采血分離獲得抗血清。采用雙向免疫擴(kuò)散法，測得制備的鼠抗金魚V

5、tg多克隆抗血清效價至少為1:16;采用蛋白印跡法(Western blot)對多克隆抗血清的特異性進(jìn)行檢測，表明在1:500倍稀釋條件下對金魚Vtg的最低檢出限為1μg/L。 利用制備的鼠抗金魚Vtg多克隆抗血清作為第一抗體，辣根酶標(biāo)記羊抗鼠IgG作為第二抗體，采用Western-blot方法定性檢高效氯氰菊酯、三唑酮、溴甲維磷、氧樂果、敵敵畏、久效磷、滅多威和草甘膦等8種農(nóng)藥的環(huán)境雌激素活性。結(jié)果表明：0.01 mg/L、

6、0.1 mg/L和1.0 mg/L氯氰菊酯、三唑酮、溴甲維磷、氧樂果、敵敵畏、久效磷6種農(nóng)藥暴露組的雄性金魚血漿均能與鼠抗金魚Vtg抗血清發(fā)生陽性反應(yīng)，表明它們能夠誘導(dǎo)雄性金魚合成和分泌Vtg，具有環(huán)境雌激素活性；滅多威和草甘膦則未檢測到陽性反應(yīng)，表明未能誘導(dǎo)雄性金魚分泌Vtg，可能不具有環(huán)境雌激素活性。 綜上，本研究用E2誘導(dǎo)金魚產(chǎn)生Vtg，分離純化后得到Vtg純品；用此Vtg純品對小白鼠進(jìn)行免疫，獲得鼠抗金魚Vtg多克隆抗