非天然氨基酸插入法構(gòu)建小鼠突變RANKL蛋白的克隆、原核表達(dá)及抗血清制備.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是主要表現(xiàn)為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨骼強(qiáng)度和負(fù)荷承受能力降低，易于發(fā)生脆性骨折的一類全身性骨代謝障礙疾病，也是多種骨破壞性疾病共有的病理損害。骨質(zhì)疏松發(fā)病率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。正常骨代謝主要依賴于破骨細(xì)胞發(fā)揮的骨吸收作用和成骨細(xì)胞發(fā)揮的成骨作用之間的平衡。任何原因?qū)е逻@種平衡的破壞都會(huì)引起骨代謝性相關(guān)疾病。其中，破骨細(xì)胞活性和功能的增強(qiáng)在這一過程中發(fā)揮著極其重要的作用。
　　核因子

2、κB受體活化因子配體（RANKL，Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand）對(duì)破骨細(xì)胞的分化、成熟及功能都發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。RANKL結(jié)合到破骨前體細(xì)胞的核因子κB活化因子受體（RANK）上，啟動(dòng)下游NF-κB，P38，ERK，JNK等信號(hào)通路，刺激破骨細(xì)胞的分化、成熟及功能。阻斷RANKL與RANK的結(jié)合，可抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟。抗RANKL單克隆抗體Denosumab可以特異性

3、地阻斷 RANKL與其受體的結(jié)合，有效地的抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟和功能，對(duì)骨質(zhì)疏松等骨吸收性疾病療效明顯。最近研究表明，在自體蛋白中插入非天然氨基酸可以突破免疫耐受，使機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)自體蛋白高滴度的抗體。
　　本研究探討非天然氨基酸突變的小鼠 RANKL蛋白（pNO2Phe234mRANKL）的克隆、原核表達(dá)和純化，以及用其作為抗原免疫小鼠，制備小鼠抗mRANKL的抗血清，并分析該抗血清的抗體滴度和活性，為進(jìn)一步探究阻斷 RANK

4、L-RANK通路的新方法奠定基礎(chǔ)。
　　方法和結(jié)果:
　?、偈紫韧ㄟ^RT-PCR克隆了具有活性的小鼠RANKL（mRANKL）的胞外段基因，將編碼第234位酪氨酸的密碼子（TGA）突變成能編碼p-硝基苯丙氨酸的密碼子，然后構(gòu)建了pET28a-pNO2Phe234mRANKL重組表達(dá)載體并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建成功。
　　②成功將pET28a-pNO2Phe234mRANKL重組表達(dá)載體與pEVOL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至E.coli BL

5、21(DE3)原核表達(dá)菌中，用阿拉伯糖和IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)并純化了目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE與Western Blot檢測(cè)，該蛋白與預(yù)測(cè)蛋白大小一致；通過高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)成功插入了p-硝基苯丙氨酸。
　?、垡约兓鞍鬃鳛槊庖咴?，采用多位點(diǎn)皮下重復(fù)注射的方法免疫小鼠，采用Western Blot和間接ELISA分別檢測(cè)抗血清活性和抗mRANKL抗體滴度。結(jié)果表明，成功制備了小鼠抗 mRANKL的抗血清，該抗血

6、清具有較高的活性，既能與pNO2Phe234mRANKL重組蛋白結(jié)合，又能與野生型mRANKL結(jié)合，效價(jià)為1:6400。
　　結(jié)論:
　　通過本實(shí)驗(yàn)，我們首次克隆并表達(dá)了p-硝基苯丙氨酸突變的小鼠RANKL（mRANKL）的胞外段，通過高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)驗(yàn)證了p-硝基苯丙氨酸的成功插入；并以此蛋白為抗原免疫小鼠，制備了小鼠抗mRANKL的抗血清，該抗血清效價(jià)為1:6400，具有較高的活性，既能與pNO2Phe234mR