hla-c和hla-g基因真核細(xì)胞雙表達(dá)載體的克隆及鑒定分析

1、’ 3 3 4 ’免 疫 學(xué) 雜 志 第 2 0卷 第 5 期 2 0 0 4 年 9月I M M U N O L O G I C A LJ O U R N A LV o 1 ．2 0N o ．5S e p t ．2 O 0 4[ 文章編號] 1 0 0 0 - 8 8 6 1 ( 2 0 0 4 ) 0 5 ． 0 3 3 4 - 0 5H L A ． C和 H L A ． G基 因真核細(xì)胞 雙表達(dá)載體 的克隆 及鑒定分析 張 磊 ，

2、 楊玨琴 ， 姚芳娟 ， 許玲娣 ， 范麗安 ( 上 海市免疫學(xué)研 究所 ， 上海第二 醫(yī)科 大學(xué) ， 上海 2 0 0 0 2 5 )[ 摘 要]目的 構(gòu)建人 } 1 】． c和 H L A - G基因真核細(xì)胞 雙表達(dá)載體 。 方法 用 R T - P C R從孕婦蛻膜組織有核細(xì)胞總 m R N A 中逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增全長 } 1 】— C和 } 1 】— Ge D N A ， 首先將 } 1 】． G經(jīng) B a mHI和 C ／ aI雙酶

3、切 ， } 1 】— C經(jīng) E c o RI和 X h oI雙酶切 后 ， 分別定 向插入真核細(xì)胞雙順反子載體 p V I T R 0 2的多克隆位點 1 ( m c s 1 ) 和 2 ( m e s 2 )中， 然后經(jīng)酶切 和測序鑒定 ， 確定 已建立 p V 1 T R O 2 的單表達(dá)質(zhì)粒 p V 1 T R O 2 一 } 1 】． G和 p V 1 T R O 2 一 H L A — C ， 再將 } 1 】— Ce D N

4、 A經(jīng) o RI和 0I雙酶切 ， 定向插入單表達(dá)質(zhì)粒 p V I T R 0 2 一 } 1 】— G的多克隆位點 2 ( m e s 2 ) 中， 經(jīng) P C R反應(yīng)初篩 ， 再經(jīng)雙酶切鑒定。結(jié)果 限制性 內(nèi)切酶和測序分析表 明已成功 構(gòu)建 了 } 1 】． C w* 0 1 0 3 和 } 1 】— G* 0 1 0 1的單表達(dá)質(zhì)粒 p V I T R 0 2 一 } 1 】— C和 p V 1 T R 0 2 一 } 1 】—

5、G以及 雙表 達(dá)質(zhì)粒 p V 1 T R 0 2 一 } 1 】— C G 。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了真核細(xì)胞雙順反子 載體 p V 1 T R 0 2的雙表達(dá)質(zhì)粒 p V 1 T R 0 2 一 } 1 】— C G ， 以及單表 達(dá)質(zhì)粒 p V 1 T R 0 2 ． } 1 】． C和 p V 1 T R 0 2 - } 1 】— G 。[ 關(guān)鍵詞] } 1 】— c ； } 1 】— G ； 雙順反子載體 p V 1 T R 0

6、2 ； 雙表達(dá)質(zhì)粒 [ 中圖分類號] R 3 9 2 ． 1 1[ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼] ACl o n ea n di d e n t i f ic a t i o no ft h ee u k a r y o t i cc o - e x p r e s s i o nv e c t o ro fh u ma nHL A- G a n dHLA- C g e n e swi Ⅱ lb i c i s t r o n i cv e c t

7、 o rp VI TRO2Z H A N GL e i ， Y A N GJ u e - q i n ， Y A OF a n g - j u a n， X UL i n g - d i ， F A NL i - a n( S h a n g h a iI n s t i t u t eo fI m mu n o l o g y ，S e c o n dM e d i c a lU n i v e r s i t y ， S h an

8、gh ai2 0 0 0 2 5 ，C h i n a )【 A b s t r a c t ]O b j e c t i v eT oc o n s t r u c te u k a r y o t i ec o - e x p r e s s i o nv e c t o ro fh u m a n} 1 】— Ca n dH L A - Gg e n e s ．Me t h o d sR T ． P C Rw a su s e d

9、t oa mp lt h ef u l l - l e n g t h} 1 】— Ca ndHL A— G e DNA f r o m t o t a lR NA o fe y t o t r o p h o b l a stk a r y o t ei np r eg n a n tw o me n．1 1 1 e} 1 】— Ge DNA丘 a g —m e n t ( d i g e s t e dw i t hB a

10、m HIa ndC ／ aI) a nd 山 e } 1 】． Ce D N Af r a g m e n t ( d i g e s t e d w it hRIa ndI) w e r ei n s e r t e d i n t ot h em u l t i p l ec l o n i n gs i t e s 1a nd2( m c s 1a ndm e s 2 ) o f t hee u k a r y o t i

11、eb i e i s t r o n i ec o - e x p r es i o nv e c t o rp V I TR O 2 ， r es p e c t i v e l y ．1 1 1 ec o n st r u c t i o no f t hes i n g l ee x p r e s s i o np l a smi dp Vr r Ro 2 ． HLA — C w 01 0 3a n dp V1 TR 02 一

12、HL A— G *01 0 1w a s b e e ne o n f i r me d b yr es t r i c t i o ne n d o n u e l e a set r e a t me n ta n ds e —q u e n e ei d e n t i f i e a t i o n ．T h e nt heI - 1 L A — C w 01 0 3e DN A f r a g me n tw a s

13、 d ir e c t i o n a l l yi n s e r t e d i n t ot heme s 2o ft hev e c t o rp Vl ' I l l O2 一 H LA - G *0 1 01 ，a ndt her e c o mb i n e d p l a smi dwa s i d e n t i f i e d b yP CRa ndr es t r i c t i o ne n d

14、 o n u e l e a se sd ig e s t i o n．Re s u l t sT h er es t r i c t i o ne n d o n u e l e a s e sd ig e st i o na nds e q u e n c i n gs u g g e s t e d t h a tt h ee u k a r y o t i ec o - e x p r e s i o nv e c t o r

15、p V m 0 2 一 mA — C Ga ndt h es i n g l eg e n ee x p r e s i o np l a s m i d sp V I T R 0 2 一 mA —Ca ndp VI TR 02 一 I - I IA ． Gwe r e c o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l y．Co n c l u s i o nT h er e c o mb i

16、 n a n te u k a r y o t i ee x pr esi o nv e c t o rp VI TR O2 一 I 。 I IA - C Ga ndt hes i n g l eg e n ee x p r e s i o np l a s m i d sp V I T R 0 2 一 H L A — Ca ndp V I T R 0 2 - m A — Gw e r ec o n s t r u c t e d s

17、 u c c e s f u l l y ．『 K e yw o r d sIm A ． C ； I - I L A — G ； B i e i s t r o n i ev e c t o rp V I T R 0 2 ； C o - e x p r e s i o nv e c t o r妊娠過 程 中， 胎 兒絨 毛外 滋養(yǎng)層 細(xì)胞 表 達(dá)特 定 mA 抗原組合 以及母體 子宮蛻膜組 織 中淋 巴細(xì) 胞分 [ 收稿 日期] 2 0

18、 0 3 — 0 9 — 3 0 ； [ 修回 日期] 2 0 0 4 — 0 3 —2 6[ 基金項目] 國家 自然科學(xué)基金( 3 o o 7 o 7 8 4 、 3 0 3 7 1 3 5 0 ) 和上海市科委重 點項 目( 0 2O J 1 4 0 5 4 ) 資助 [ 作者簡介] 張 磊( 1 9 7 1 一) ， 女 ， 黑龍江哈 爾濱市人， 主治 醫(yī)師， 博士 生 ， 主要從 事 I R A 結(jié)構(gòu)及功 能 的研 究：T e

19、l ： ( 0 2 1 ) 6 3 8 4 6 5 9 0 - 7 7 6 5 4 1 ； E — m a i l ： l e i z h a n g c o m@1 2 6 ． c o m* 通訊作 者 布格局形 成 了妊 娠早 期 母 胎 界 面獨 特 的組 織 學(xué) 特 點 ， 即胎 兒 絨 毛 外 細(xì) 胞 滋 養(yǎng) 層 細(xì) 胞 不 表 達(dá) 經(jīng) 典 的 H I A ． A、 ． B及 H I A Ⅱ類分 子 ， 只表 達(dá)非 經(jīng)典 mA

20、 I類分 子 H I A ． E 、 G及經(jīng)典 H I AI 類分子 mA． C ‘， 可 以猜想 ， 這 個 格 局 的分 布 與 母． 胎 耐 受 必 定 密 切 相 關(guān) 。我 室 將 從 同一 個 體 蛻 膜 組 織 合 成 mA． C 和 H L A - G 的 e D N A ， 利 用 高 效 表 達(dá) 兩 個 基 因 的 載 體 P v i t r o 2 ， 構(gòu)建雙基 因 H I A ． C G載 體 ， 并 轉(zhuǎn) 染不

21、表 達(dá)經(jīng) 典 H I AI類 分 子 ， 而 僅 表 達(dá) 有 少 量 mA． E 的 維普資訊 http://www.cqvip.com · 3 3 6 ·免 疫 學(xué) 雜 志 第 2 0 卷 V I R E S63 2 1b p：m c s 2 』?‘ ：一s v 4 0 p A n - lT ? ?C I a1 ( 41 5 0 1W C S I5 U TRS V 4 0Eh t e r H p r o m 圖

22、 3 重組 質(zhì)粒 p V I T R 0 2 一 Ⅷ — C GF i g3Th er e c 0 r n b i m n tp l a s map VI T R0 2 一 HL A — CG2 結(jié)果 2 ． 1 母 體 絨 膜 組 織 細(xì)胞 總 R N A 的提 取 及 電泳 鑒 定 提取 的總 R N AA比值為 2 ． 0 5 17 ， 表 明總 R N A較純 ， 經(jīng) 甲醛變性瓊 脂糖 電泳 ， 可見 2 8 S 、 1 8 S

23、和 5 S3 條帶 ， 提示 R N A沒有降解 ， 可用于 R T - P C R 。2 ． 2H L A - C和 I - t E A - G全 長基 因 的 P C R擴(kuò)增 以 同一個體絨膜組織 c D N A為模板 ， 用設(shè)計引物進(jìn)行 P C R擴(kuò)增 ， 所得 } Ⅱ一 C和 } Ⅱ一 G特異性 條帶 均與預(yù) 期 的 12 8 5b p和 16 1 7b p目的基 因接近 ( 圖 4 ) 。123h p20 3 6— — ’16

24、 3 6— 101 8—}5 0 6— 1 ) 1k bD N Al a d d e r ； 2 ) H L A — C ； 3 ) H L A — G圖 4 Ⅷ ． G和 Ⅷ ． C全 長基 因的 P C R產(chǎn) 物 F i g4P C R p r o d u c t so ff i f l l - l e n g t hHL A - Ca n dHL A - Gg e n e s象 萱■ 1 ) k D N M H ／ r i d

25、n l ； 2 — 5 ) p V 1 T R 0 2 一 } Ⅱ A— G ／B a mHI+C ／ aI；6 — 9 ) p V 1 T R 0 2 ． }A — C ／ E c o RI+X h o I； 1 0 ) 10 0 ob pM a r k e r圖 5p V I T R O 2 ． Ⅷ ． c和 p V 1 T R O 2 ． Ⅷ ． G單表達(dá)質(zhì)粒酶切 鑒 定結(jié) 果 F i g5I d e n t i f i c a

26、t i o no fp V 1 T R O 2 一 H L A — Ca n dp V I T R O 2 一 m A — Gb yr e s t r i c l l o ne n d o n u c l e a s e sd i g e s t i o n2 ． 3單 表 達(dá) 質(zhì) 粒 p V I T R O 2 - l 玎- C 和 p V I T R O 2 -H L A - G 的酶 切 鑒 定 單 表 達(dá)質(zhì) 粒 p V I T

27、R O 2 ． } Ⅱ一 C和 p V r r R O 2 一 } Ⅱ． G 分 別 經(jīng) E c o RI + X h oI 和 B a m HI+C l aI雙酶切消化 ， 均 能被切開 ， 分別產(chǎn) 生 12 8 5b p 和 63 2 1b p ( 圖 5 中第 6 — 9 泳道 ) 、 16 1 7b p和63 2 1 b p ( 圖 5 中第 2 ～ 5 泳道) ， 初步表明單表達(dá)質(zhì) 粒帶有 } Ⅱ一 C和 } Ⅱ． G基 因。

28、2 ． 4 測序分析 測序結(jié)果經(jīng)計算機(jī)分析 ， 經(jīng) G e n eB a n kb l a s t 比對 ， 與 已知 } Ⅱ一 C w* 0 1 0 3和 } Ⅱ一 G*0 1 0 1 序列 相 符 ， 說 明本 實驗 已成功 構(gòu) 建 } Ⅱ一 C w*0 1 0 3和 } Ⅱ— G* 0 1 0 1 的單表達(dá)質(zhì)粒 p V I T R O 2 一 } Ⅱ一 C和 p V I T R O 2 一 } 玎一 G 。2 ． 5 重組雙表達(dá)質(zhì)

29、粒 p V I T R O 2 ． I - I L A - C G 的酶切 鑒 定 重組質(zhì) 粒 分別 經(jīng) E c o RI和 X h oI、 B a mHI和 X h oI、 B a mHI和 C ／ aI、 B a mHI和 E c o RI不 同酶 組合雙酶切 消化 ， 均能被切 開 ， 分別產(chǎn) 生 12 8 5b p和 79 3 8b p、 24 3 3b p 和 67 9 0b p 、 16 1 7b p 和 76 0 6b p

30、、37 3 0b p 和 54 8 3b p ( 圖6中 第 2 、 3 、 8 和9 泳道) ?？召|(zhì) 粒 p V I T R O 2 經(jīng) E c o RI 和 X h oI、 B a mHI 和 X h oI、 B a mHI和 C ／ aI、 B a mHI和 E c o RI 雙 酶切 消化后 ， 分 別 產(chǎn) 生 63 0 9b p 、 24 3 3b p和 38 8 8b p 、63 0 8b p 、 24 4 5b p 和38

31、 7 6b p 。( 圖6 中第 4 、 5 、 6 和 7泳道 ) 。1 ) h D N M H ／ n dn l ； 2 ) p V 1 T R 0 2 一 } Ⅱ A — C G ／ E c o RI +X h oI； 3 )p V 1 T R G 2 一 } Ⅱ A ． C G ／ B a m HI+X h oI； 4 ) p V I T R 0 2 ／ E c o RI +X h oI；5 ) p V 1 T R 0 2 ／

32、B a m HI + X h oI；6 ) p V 1 T R 0 2 ／ B a m HI + C ／ aI；7 ) p V 1 T R 0 2 ／ B a mHI + E c o RI； 8 ) p V 1 T R 0 2 一 } Ⅱ A — C G ／ B a mHI +C ／ aI； 9 ) p V 1 T R O 2 ． }A ． C G ／ B a mHI+ E c o RI； l o ) 1k bD N Al a d —d

33、 e r圖 6p V I T R 0 2 ． Ⅷ ． C G重組質(zhì) 粒酶 切鑒 定 結(jié)果 F i g6I d e n t i f i c a t i o no fp VI TR O2 - HL A - C G b yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sd ig e s t i o n3 討論 正常妊娠時， 胎兒作為“ 半 同種移植物” 不被母 體排斥 的現(xiàn)象 一直備 受關(guān) 注 。

34、妊 娠過 程 中 ， 胎兒 絨 膜外滋 養(yǎng)層細(xì)胞侵襲蛻膜化 的孕婦子 宮 內(nèi)膜及其 血 管以形成有生機(jī)的胎兒一 胎盤單位， 直接與母體細(xì)胞 聯(lián)系。從理論上說 ， 胎兒 具有 的父源 M H C抗原 ( 人 類主要組織相容性抗原 ) ， 應(yīng)該為母體淋巴細(xì)胞識 別 ， 產(chǎn)生排斥反應(yīng) ， 但事實并非如此 。母胎 交界局 部 存在 復(fù)雜的免 疫應(yīng) 答 和免疫 調(diào)節(jié)機(jī) 制 ， 母胎 免疫 耐 受現(xiàn)象是一 個多 因素 、 多 系統(tǒng)共 同參 與 的主