巨噬細(xì)胞極化和HLa-G異常在ITP中的作用和調(diào)控研究.pdf

1、第一部分:巨噬細(xì)胞異常極化在ITP中的作用及調(diào)控研究
　　研究背景:
　　免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia，ITP)是一種常見的自身免疫性出血性疾病，主要表現(xiàn)為患者血小板計(jì)數(shù)降低，出血風(fēng)險(xiǎn)增高?；颊唧w內(nèi)自身抗體介導(dǎo)血小板被單核/巨噬細(xì)胞過度清除和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)血小板的直接殺傷是造成血小板破壞增多的重要原因，而另一方面，免疫介導(dǎo)的巨核細(xì)胞成熟障礙、凋亡異常會(huì)導(dǎo)致血小板生成不足。其中多種細(xì)

2、胞免疫異常，包括Th1/Th2亞群失衡，髓樣/淋巴樣樹突狀細(xì)胞(myeloid/lymphoid dendritic cells，mDCs/1DCs)比例增高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)、耐受性DC細(xì)胞數(shù)量及功能缺陷等均參與了ITP的發(fā)病。巨噬細(xì)胞在固有免疫及適應(yīng)性免疫中都起到了關(guān)鍵性的作用，然其在ITP發(fā)病中的作用還有待研究。
　　根據(jù)激活后巨噬細(xì)胞的表型及功能可以將其分為兩類:經(jīng)典激活的巨

3、噬細(xì)胞(classically activated macrophage，M1)和替代激活的巨噬細(xì)胞(alternativelyactivated macrophage，M2)。M1型巨噬細(xì)胞由干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）和革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激活化，表現(xiàn)為共刺激分子(CD80，CD86)表達(dá)增高，抗原遞呈能力增強(qiáng)，分泌大量的促炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(i

4、nterleukin，IL)-12等，發(fā)揮Th1型宿主免疫功能。M2型巨噬細(xì)胞由IL-4、IL-13及免疫復(fù)合物等刺激活化，表現(xiàn)為甘露糖受體(mannosereceptor，MR)，清道夫受體(scavenger receptor，SR)表達(dá)增高，分泌抗炎性細(xì)胞因子，包括IL-10等，誘導(dǎo)Tregs生成，發(fā)揮Th2型抗炎作用。M1/M2型巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)能夠影響淋巴細(xì)胞亞群分化并改變其免疫耐受功能，從而參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)

5、展，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化等。然而，巨噬細(xì)胞的異常極化是否參與了ITP的發(fā)病，目前尚缺乏研究證實(shí)。
　　大劑量地塞米松(High-dose dexamethasone，HD-DXM)沖擊治療是國際公認(rèn)的ITP臨床治療的首選方案。然而，HD-DXM治療ITP的機(jī)制尚不完全明確，且仍有約1/3患者長期應(yīng)用激素治療無效。近年來，雖然有重組人促血小板生成素受體激動(dòng)劑（recombinant human thrombopoietin

6、receptor agonist，TPO-RA）、利妥昔單抗等新型藥物的出現(xiàn)，部分患者仍對(duì)各種治療反應(yīng)不佳，遷延不愈進(jìn)展為難治性ITP。全反式維甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)是一種誘導(dǎo)分化劑，也是一種免疫調(diào)節(jié)劑，在多種自身免疫性疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，狼瘡腎炎中取得較好的療效。Dai等人在最近的研究中發(fā)現(xiàn)ATRA聯(lián)合潑尼松在難治復(fù)發(fā)性ITP患者中達(dá)到54.3％的總體有效率。研究發(fā)現(xiàn)，ATRA能夠直接誘

7、導(dǎo)T細(xì)胞分化，并能誘導(dǎo)DC向耐受性分化。ATRA聯(lián)合IL-4還能夠有效上調(diào)小鼠精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)的表達(dá)，而Arg-1被廣泛認(rèn)為是小鼠M2型巨噬細(xì)胞活化的重要標(biāo)志之一。然而，ITP中是否存在巨噬細(xì)胞異常極化，HD-DXM和ATRA能否通過調(diào)節(jié)M1/M2極化在ITP中發(fā)揮治療作用，尚需要體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的多方驗(yàn)證。
　　目的:
　　(1)探究ITP中巨噬細(xì)胞的極化現(xiàn)象及其功能，明確其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用

8、。
　　(2)探究HD-DXM或ATRA對(duì)巨噬細(xì)胞極化及功能的調(diào)節(jié)作用，揭示HD-DXM和ATRA治療ITP的可能作用靶點(diǎn)。
　　方法:
　　(1)收集ITP切脾患者及外傷脾破裂患者脾臟各5例，冰凍組織切片，分別標(biāo)記抗人-CD68、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)或CD163，熒光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)CD68+ iNOS+細(xì)胞(M1)和CD68+CD163+

9、細(xì)胞(M2)的數(shù)量。
　　(2)入組未經(jīng)治療的ITP患者20例，采集外周血10ml，分選CD14+單核細(xì)胞，體外加入巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)誘導(dǎo)為M0巨噬細(xì)胞，并分別以LPS+IFN-γ或IL-4誘導(dǎo)為M1，M2。
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測M1和M2表面CD163，CD206，CD209，CCR7，CD86和CD80的表達(dá)。
　　(4)

10、酶聯(lián)免疫標(biāo)記法(enzyme-linked immunoabsorbent assay，ELISA)測定巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12、TNF-α及IL-10的含量。
　　(5)將誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞分別與CD4+和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，5天后流式測定CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖情況，CD4+CD49b+LAG-3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TypeⅠregulatory T cell，Tr1)的比例。
　　(6)收集巨噬細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞

11、共培養(yǎng)上清，多因子試劑盒檢測輔助性T細(xì)胞Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子的含量。
　　(7)上述20例未經(jīng)治療的ITP患者經(jīng)HD-DXM治療，另收取激素治療無效的ITP患者23例，應(yīng)用ATRA+潑尼松聯(lián)合用藥，分別收集兩種藥物治療前后患者的外周血，體外誘導(dǎo)為M1，M2，測定其表型及對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)熒光共聚焦顯微鏡顯示ITP患者M(jìn)1數(shù)量高于脾破裂患者（5.4±0.9 vs2.8±0.8，P＜

12、0.05），M2數(shù)量未見明顯差別(3.0±0.7 vs3.2±1.3，P＞0.05)。
　　(2)流式結(jié)果顯示ITP患者來源的M1和M2表面CD86和CD80的表達(dá)明顯高于正常人;經(jīng)DXM和ATRA干預(yù)后， M1和M2表面CD86，CD80，趨化因子受體7(C-C chemokine receptor type7，CCR7)的表達(dá)均降低，且DXM干預(yù)后CD163表達(dá)增加，ATRA干預(yù)后CD209的表達(dá)增加。
　　(3) EL

13、ISA結(jié)果顯示與正常對(duì)照相比，ITP來源的M1和M2分泌IL-12p70，TNF-α顯著增高;經(jīng)DXM或ATRA干預(yù)后的M1，M2分泌IL-12p70和TNF-α減少，而IL-10增加。
　　(4)將巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示ITP患者來源的巨噬細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖的能力明顯高于正常人;經(jīng)DXM或ATRA調(diào)控的M1，M2對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖表現(xiàn)出明顯的抑制，且DXM或ATRA調(diào)控后的M2巨噬細(xì)胞能顯著擴(kuò)增

14、Tr1細(xì)胞亞群。
　　(5)檢測共培養(yǎng)上清中Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果顯示DXM預(yù)處理的ITP患者M(jìn)1和M2細(xì)胞能夠增加CD4+T細(xì)胞分泌IL-4，IL-5和IL-13的能力并減少IFN-γ，IL-2和IL-12的分泌。ATRA預(yù)處理的ITP患者M(jìn)1和M2同樣增加CD4+T細(xì)胞分泌IL-4，IL-5和IL-13并減少IL-2和IL-12的分泌，然而只有ATRA預(yù)處理的M2型巨噬細(xì)胞能夠減少CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的能力

15、。
　　(6)本研究中，HD-DXM在未經(jīng)治療的ITP中總體有效(overall response，OR)率為85％，且治療有效患者治療后外周血單核細(xì)胞來源的M1和M2表面CD86，CD80，CCR7的表達(dá)均降低，CD163表達(dá)增加，與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力減弱;ATRA應(yīng)用于難治性ITP中，OR率為69.6％，治療有效者治療后單核細(xì)胞來源的M1和M2表面CD86，CD80，CCR7的表達(dá)均降低， C

16、D209表達(dá)增加，與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)后，明顯降低CD4+T細(xì)胞增殖能力。治療無效者治療前后巨噬細(xì)胞表型及功能均無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　(1) ITP中存在巨噬細(xì)胞向M1型過度極化的現(xiàn)象，且患者巨噬細(xì)胞免疫耐受功能受損。
　　(2) HD-DXM或ATRA能夠糾正ITP患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞的極化異常，誘導(dǎo)其向M2型極化，重塑機(jī)體免疫耐受。
　　(3)這一研究揭示了ITP發(fā)病的新機(jī)制，并證明了巨噬細(xì)胞為HD-D

17、XM及ATRA在ITP中發(fā)揮治療作用的靶點(diǎn)之一。
　　第二部分:HLA-G表達(dá)異常在ITP發(fā)病中的作用及調(diào)控研究
　　研究背景:
　　ITP是一種常見的自身免疫性疾病，免疫失耐受是ITP中血小板破壞的重要原因之一。多種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞異常，包括自身反應(yīng)性T、B細(xì)胞過度活化擴(kuò)增，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory B cells，Bregs)、耐受性樹突狀細(xì)胞

18、(dendritic cells，DCs)、髓源抑制性細(xì)胞(Myeloid-derivedsuppressor cells，MDSCs)數(shù)量及功能異常等，致使機(jī)體免疫耐受不能維持。繼而自身免疫紊亂導(dǎo)致血小板被過度破壞，且巨核細(xì)胞成熟障礙造成血小板生成不足。
　　人白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)是一種非經(jīng)典HLAI類分子，包括膜結(jié)合型HLA-G(membrane-bound HLA-G

19、，mHLA-G)和可溶性HLA-G(soluble HLA-G，sHLA-G)兩種形式。目前發(fā)現(xiàn)的能夠識(shí)別并結(jié)合HLA-G分子的免疫球蛋白樣受體主要有三種:免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物2(immunoglobulin-like transcript2，ILT2/CD85j)、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物4(immunoglobulin-like transcript4，ILT4/CD85d)及殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunog

20、lobulin-like receptor，KIR2DL4/CD158d)。上述受體在T、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷性細(xì)胞(natural killer ceils，NKs)表面存在差異性表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞可分泌或表達(dá)HLA-G，并通過與上述細(xì)胞表面的耐受性受體結(jié)合發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等患者體內(nèi)均存在HLA-G表達(dá)及功能異常，致使機(jī)體免疫失耐受或發(fā)生炎性紊亂。然而，HLA

21、-G在ITP中的作用尚有待研究。
　　目的:
　　(1)探究HLA-G及其受體在ITP中的表達(dá)，并明確其在各種免疫細(xì)胞中的作用。
　　(2)剖析體外應(yīng)用重組人HLA-G蛋白（recombined human HLA-G，rhHLA-G），對(duì)糾正ITP免疫細(xì)胞功能異常的作用及機(jī)制，探尋ITP治療的新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　(1)收集30例ITP患者和15例正常對(duì)照的外周血，分離血漿、血小板、單個(gè)核細(xì)胞（per

22、ipheral blood mononuclear cells，PBMCs），免疫磁珠分選CD14+單核細(xì)胞。
　　(2)改良單克隆抗體血小板抗原固定試驗(yàn)(modified monoclonal antibody specificimmobilization of platelet antigens，MAIPA)測定ITP患者抗血小板特異性自身抗體的表達(dá)。
　　(3)酶聯(lián)免疫標(biāo)記(enzyme-linked immunoab

23、sorbent assay，ELISA)測定ITP患者及正常對(duì)照血漿中sHLA-G的表達(dá)。
　　(4) PBMC中加入外源性rhHLA-G培養(yǎng)3天后，流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，CD14+單核細(xì)胞和CD19+B淋巴細(xì)胞表面mHLA-G和ILTs的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞的比例變化。
　　(5)將rhHLA-G治療3天后的PBMCs與自體或異體血小板共培養(yǎng)4小時(shí)，線粒體膜

24、電位檢測試劑盒(mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)測定血小板凋亡。
　　(6) CD14+單核細(xì)胞加入粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony stimulating factor，GM-CSF)和IL-6，培養(yǎng)5天后，加入LPS和rhHLA-G，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，收集DCs，測定DCs表面CD86、CD80的表達(dá)。<

25、br>　　結(jié)果:
　　(1)抗血小板自身抗體陽性的ITP患者體內(nèi)HLA-G表達(dá)較正常人明顯降低，而抗體陰性者與正常人無明顯差異。
　　(2)與正常對(duì)照相比較，ITP患者CD4+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞表面mHLA-G和ILT2表達(dá)明顯降低，CD14+單核細(xì)胞mHLA-G和ILT4表達(dá)降低。rhHLA-G能夠上調(diào)上述細(xì)胞表面ILTs的表達(dá)。
　　(3) rhHLA-G能夠減少ITP患者PBMCs對(duì)自體及異體血小板的殺傷作

26、用。
　　(4) rhHLA-G能夠降低DCs表面CD86和CD80的表達(dá)。
　　(5) rhHLA-G不能擴(kuò)增ITP患者體內(nèi)CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　(1) ITP中HLA-G和其抑制性受體ILTs表達(dá)降低。
　　(2) rhHLA-G能夠上調(diào)抑制性受體的表達(dá)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抑制功能。
　　(3)這一研究揭示了ITP發(fā)病的新機(jī)制，為ITP的治療提供了新思路。