IRF5調(diào)控的肺泡巨噬細胞極化在SAP肺損傷中作用的實驗研究.pdf

1、目的:
　　(1)建立重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷小鼠模型，確定肺損傷程度最嚴重的時間點。
　　(2)闡明肺泡巨噬細胞極化與SAP肺損傷之間的關系。
　　(3)研究干擾素調(diào)節(jié)因子5(IRF5)在肺泡巨噬細胞極化調(diào)控中的作用。
　　(4)進一步探討體內(nèi)實驗中慢病毒介導的IRF5干擾(IRF5 shRNA)對SAP肺損傷的干預作用。
　　方法:
　　(1) SAP肺損傷小鼠模型的建立及肺損傷程度的評估:

2、雨蛙素聯(lián)合脂多糖腹腔注射制備SAP肺損傷小鼠模型，通過胰腺、肺組織病理學評分，血清淀粉酶、肺組織濕干重比(W/D)、肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性、丙二醛(MDA)含量、TNF-α和IL-1β檢測等方法證實建模成功并進行肺損傷程度評估，進一步確定小鼠肺損傷最嚴重的時間點。
　　(2)肺泡巨噬細胞極化與SAP肺損傷之間的關系:通過流式細胞技術檢測SAP肺損傷小鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞及其它炎癥細胞的含量。實時定量PCR檢測巨噬細胞相

3、關炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量。通過免疫組織化學染色法及激光共聚焦免疫熒光染色法觀察肺泡M1、M2型巨噬細胞浸潤與肺損傷之間的關系。
　　(3)研究IRF5在肺泡巨噬細胞極化調(diào)控中的作用:通過流式細胞儀分選出肺泡M1、M2型巨噬細胞，實時定量PCR檢測IRF5在肺泡M1、M2型巨噬細胞中mRNA水平的表達。IRF5小干擾RNA(IRF5 siRNA)轉染肺泡M1型巨噬細胞，通過實時定量PCR、Western blottin

4、g檢測轉染后M1、M2型巨噬細胞標志性分子mRNA水平和蛋白水平的表達，鑒定其極化狀態(tài)的變化。
　　(4)IRF5 shRNA對SAP肺損傷保護作用的研究:制備慢病毒介導的IRF5干擾病毒，并確定干擾效果最顯著的序列作為后續(xù)IRF5基因的干擾片段。將IRF5 shRNA通過尾靜脈注射感染小鼠，24h后建模，通過肺組織病理學評分，血清淀粉酶、肺組織濕干重比、MPO活性、MDA含量測定、TNF-α、IL-1β檢測和免疫組織化學染色法、

5、激光共聚焦免疫熒光染色法等方法評價肺組織損傷程度，檢測肺泡巨噬細胞極化狀態(tài)的改變，評價IRF5 shRNA對SAP肺損傷是否有保護作用。
　　結果:
　　(1)成功建立了SAP肺損傷小鼠動物模型，確定了SAP建模后48h為小鼠急性肺損傷最嚴重的時間點。
　　(2)肺泡巨噬細胞的極化狀態(tài)同SAP肺損傷具有密切的聯(lián)系。肺損傷早期（SAP后24h），此時處于炎癥進展期，以M1型肺泡巨噬細胞占據(jù)優(yōu)勢;肺損傷后期（SAP后96h

6、），炎癥逐漸過渡到修復期，M2型肺泡巨噬細胞數(shù)量明顯增多。
　　(3) IRF5在肺泡M1型巨噬細胞中的表達量明顯高于肺泡M2型巨噬細胞，有顯著性差異（P＜0.01）。IRF5 siRNA轉染肺泡M1型巨噬細胞后，TNF-α、IL-12、iNOS mRNA相對表達量較未處理M1型巨噬細胞顯著降低，有顯著性差異（P＜0.01）。IL-10、Arg-1 mRNA相對表達量較對未處理M1型巨噬細胞明顯增加，有顯著性差異（P＜0.01），

7、與未處理M2型巨噬細胞比較，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。IRF5 siRNA轉染肺泡M1型巨噬細胞后，巨噬細胞極化狀態(tài)向M2型巨噬細胞轉換。
　　(4) IRF5 shRNA組同生理鹽水組及Scramble shRNA組比較，肺損傷程度明顯減輕。肺泡M1型巨噬細胞明顯減少，M2型巨噬細胞顯著增多，肺泡巨噬細胞極化狀態(tài)由M1向M2轉換。
　　結論:重癥急性胰腺炎建模后48h為小鼠急性肺損傷程度最嚴重的時間點。肺損傷早期階段，