致病微生物新型檢測方法及預防體系應用研究.pdf

1、目的:致病微生物作為醫(yī)學診斷以及食品衛(wèi)生檢測領域最為重要的檢測指標之一，一直被全世界微生物專家所關注。尋找一種快速、簡便的微生物檢測技術以及設計一種適用于整個食品生產過程的預警體系成為控制致病微生物感染和食品污染的重要手段之一。蛋白質和核酸是微生物體中最重要的兩類生物分子，依靠抗體或者痕量核酸，借助不同熒光激發(fā)染料或傳感技術已經成為當今世界致病微生物檢測方法研究的探索前沿。本研究皆在依據(jù)其最新技術，開發(fā)一系列新型致病微生物快速檢測方法以

2、及預防應用體系，以降低最終致病微生物的感染和對食品的污染。
　　方法:(1)借助納米金顆粒對于熒光染料具有的淬滅特性，依靠核酸適配體對于目標特異分子高特異性的親和能力，通過溶血性鏈球菌單鏈DNA核酸適體，既可以與菌體蛋白特異結合又能與互補寡聚核苷酸形成雙鏈的特點，引入實際樣品到反應體系后熒光信號由淬滅變?yōu)榧ぐl(fā)，通過判斷熒光信號強度來實現(xiàn)對溶血性鏈球菌的檢測。(2)借助缺失DNA位點的獨特分子信標和互補核苷酸序列設計，巧妙利用DNA

3、莖環(huán)結構和互補核苷酸序列雜交互補金黃色葡萄球菌特異DNA序列的特點，通過核苷酸結構構相改變，迫使ATMND(2-氨基-5，6，7-三甲基-1，8-萘啶)染料離開缺失位點被重新激發(fā)熒光，通過檢測熒光信號強度來判斷金黃色葡萄球菌的存在。(3)通過自主免疫大腸埃希氏菌O157∶H7菌體抗原、建立雜交瘤細胞株，依靠血清凝集實驗以及酶聯(lián)免疫抗體鑒定效價等手段，自主免疫并獲得大腸埃希氏菌O157∶H7單克隆抗體。(4)研發(fā)一種基于抗原抗體特異性的酶

4、聯(lián)免疫反應快速檢測大腸埃希氏菌O157∶H7的電化學生物免疫傳感方法。方法采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應體系，結合堿性磷酸酶等催化銀單質特性，依托玻璃作為芯片基底的微間隙插指電極陣列傳感器件，根據(jù)生物傳感器電化學相關信號強度的變化，實現(xiàn)對大腸埃希氏菌O157∶ H7的分析。(5)依靠食品加工企業(yè)微生物危害分析與關鍵控制點原理，對容易造成微生物污染的醬肉類企業(yè)進行風險干預，再通過微生物危害性控制點進行評估，找出加工過程微生物污染關鍵控制點環(huán)節(jié)，

5、建立相關微生物污染預防體系，運用傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法以及自主開發(fā)無標記染料分子信標探針技術等檢測手段，綜合降低微生物污染的可能。
　　結果:(1)借助核酸適配體對于溶血性鏈球菌高特異性的親和能力，其方法檢測該菌線性范圍為4.9102-4.9107CFU/mL，最低檢出限理論值為33 CFU/mL。(2)依靠無標記染料結合基因缺失位點設計分子信標序列探針與互補核苷酸序列探針，當金黃色葡萄球菌的特異性序列出現(xiàn)后，其熒光強度數(shù)值迅速增強，而

6、沒有金黃色葡萄球菌的目標序列存在時熒光強度變化不明顯。熒光強度的變化可以直接反應出細菌的存在與否。(3)通過對大腸埃希氏菌O157∶H7菌體抗原進行小鼠免疫，得到效價穩(wěn)定、質量可靠的大腸埃希氏菌O157∶H7單克隆抗體，其免疫小鼠后腹水效價達到1∶104。(4)微陣列間隙插指電極表面在堿性磷酸酶的催化作用下，出現(xiàn)沉積的單質銀顆粒，從而改變導電性狀，結果顯示當大腸埃希氏菌O157∶H7濃度為1103CFU/mL、1105CFU/mL、11

7、08CFU/mL時線性關系良好，同時，本方法對于其他對照革蘭陽性和革蘭陰性菌具有明顯的非特異性。該器件完全可達到國家相關準則對于微生物“檢出或未檢出”的檢測要求。(5)微生物預防與控制體系在該企業(yè)進行初步應用后，微生物出廠檢驗合格率的差異具有顯著性意義，且金黃色葡萄球菌檢出時間由72小時縮短到24-48小時左右。
　　結論:借助核酸和蛋白質的痕量分析檢測方法在臨床診斷、衛(wèi)生檢驗與食品監(jiān)督領域擁有巨大的應用前景。由于基因探針系列方法

8、判斷致病微生物的存在是通過熒光分光光度計進行分析，同時，該實驗方法所需的試劑價廉且易獲得，核酸適體序列也易合成，對人員操作技能的要求也不高，故檢測體系通用性很強，本實驗原理適用于不同種類的微生物檢測。同時，操作簡單、反應迅速、特異性高、靈敏度強、試劑攜帶方便、檢測方法具有廣闊的應用前景和市場需求。本研究中所開發(fā)的玻璃基底微陣列間隙插指電極芯片較傳統(tǒng)硅材料芯片價格低廉，對實驗操作技能的要求也不高，完全可以在不久的將來取代現(xiàn)有包括臨床檢驗以