微生物快速檢測方法

1、微生物快速檢測方法簡介,常見微生物檢測項目,常規(guī)微生物項目 細菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、霉菌及酵母菌致病微生物項目 沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等,傳統(tǒng)計數(shù)改良法1、培養(yǎng)膜法2、螺旋平板計數(shù)法：螺旋接種儀＋菌落計數(shù)3、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測快速檢測的新方法1、ATP生物熒光法2、電阻抗法3、顏色變化4、流式細胞技

2、術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測量法,常規(guī)微生物檢測方法,培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù),原理 二片塑料膜構(gòu)成，上薄為蓋，下厚為培養(yǎng)基。操作方法：　檢樣稀釋→取1ml滴于下膜正中央→蓋上膜→擴展器壓成20cm2圓圈 →37℃培養(yǎng)24h →計數(shù)(顯色的斑點),培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù),優(yōu)點：可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基?？晒?jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時間、人力和費用。因為有顯色劑和小方格，計數(shù)方便。

3、節(jié)約稀釋的繁瑣動作?？煽焖贉y試致病菌，節(jié)省大量的實驗步驟。缺點成本比傳統(tǒng)方法要稍高些。測試細菌總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌時不能節(jié)約培養(yǎng)時間。,培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù),應(yīng)用細菌總數(shù)　測試片中含有一種紅色指示染劑，使所有菌落易認別計數(shù)。大腸菌群 測試片中含有指示劑，使菌落為紅色，且有氣泡產(chǎn)生。大腸桿菌　指示劑可使所有菌落為紅色，并可留住大腸桿菌產(chǎn)生的氣泡?！?4小時可確定大腸桿菌數(shù)。,霉菌和酵母菌計數(shù)　測試

4、片中加入的抗生素，可以抑制細菌生長；指示劑使酵母菌易認別計數(shù)；霉菌可產(chǎn)生特有的色澤。金黃色葡萄球菌　使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應(yīng)片，核酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌，26小時可確認結(jié)果。,培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù),螺旋平板法,DWS螺旋平板接種儀,自動菌落計數(shù)儀,原理　 樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。 當(dāng)用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時，菌液體積減 少，注入的體積

5、和瓊脂半徑間存在指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時菌落 沿注液線生長。用一計數(shù)的方格來校準(zhǔn)與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計數(shù)每個區(qū)域的已知菌落數(shù)，在計算細菌濃度。,螺旋平板法,,,,,平皿旋轉(zhuǎn),接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍,,,阿基米德螺旋型軌跡,螺旋平板法,優(yōu)點與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點檢測時間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時。需要配合自動菌落計數(shù)儀，否則人工計數(shù)更麻

6、煩。,螺旋平板法,濾膜法,濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。優(yōu)點　靈敏度增大，菌落無擴散情況，便于計數(shù)。缺點 需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。,ATP生物熒光法,原理 ATP＋螢光素+螢光素酶+O2—AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光應(yīng)用用于食品生產(chǎn)線和管道進行快速清潔程度檢測

7、。用于水質(zhì)檢測。改良后用于食品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗。,10秒獲得結(jié)果,涂抹采樣,混合:震蕩5s,檢測,,,表面清潔度/水質(zhì)檢測,ATP生物熒光法,ATP法檢測成品的優(yōu)缺點優(yōu)點：大大縮短庫存時間，減少物流壓力和成本。缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，有存在假陰性的可能。,ATP生物熒光法,電阻抗法測定細菌總數(shù),原理　供細菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體，在特制的測量管底部裝入電極插

8、頭，即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進行檢測。阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長過程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂類、蛋白質(zhì)等）被分解成小分子代謝物，即較小的帶電離子（乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等）這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集，增強了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能，從而降低了其阻抗值。,M=(R0-RT)/R0×100% 其中R0表示開始時培養(yǎng)基的阻抗值　　RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值　　M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分數(shù)。電

9、阻越小細菌活動越多，在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位的對數(shù)Log(CFU)與IDT（阻抗檢測時間）呈直線關(guān)系。,電阻抗法測定細菌總數(shù),優(yōu)缺點：電阻抗法較省力，樣品細菌數(shù)在4～18小時內(nèi)出結(jié)果。但對于菌數(shù)太低的不好，樣品中還不能用防腐劑，否則結(jié)果是亂七八糟的。電阻抗法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線過程中工作量較大，但以后的檢測簡便的多，不需要一系列稀釋，只需樣品1ml，培養(yǎng)基9ml，測量管一只。,電阻抗法測定細菌總數(shù),通過顏色變化檢測,微生物生長導(dǎo)致培養(yǎng)基p

10、H值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測器檢測底部瓊脂層　的顏色變化，記錄達到突變點的時間。與阻抗法類似，可以實現(xiàn)快速檢測。缺點：需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。,梅里埃的BacT/Alert微生物檢測儀,基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強度。光強度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。,流式細胞技術(shù),原理　液體樣品流過儀器中的激光照射的流動池，當(dāng)微生物流過

11、顯微鏡聚焦的流動池時就能被自動地檢測到。特點　檢測方法與使用的儀器有高度的特異性，所以應(yīng)遵循生產(chǎn)廠商提供的方法。,FOSS公司BactoScan FC牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀采用流式細胞原理。對微生物進行核酸染色，用流式細胞技術(shù)進行計數(shù)。優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時)缺點：死活細胞一起檢測，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細菌總數(shù)。,流式細胞技術(shù),美國Chemunex公司微生物快速檢

12、測系統(tǒng)將流式細胞技術(shù)與活細胞熒光探針標(biāo)記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。其最大的特點是只檢測活細胞數(shù)，速度極快，處理量大。檢測步驟：1、過濾；2、標(biāo)記，直接對活細胞和酵母進行標(biāo)記；3、激光掃描。,流式細胞技術(shù),三種型號的差異,√,√,利用細菌生長時產(chǎn)生熱量的原理設(shè)計而成。微生物在生長和代謝的過程中，能產(chǎn)生大量的代謝熱。由于各種微生物的代謝

13、產(chǎn)物熱效應(yīng)不同，因此可顯示出特異性的熱效應(yīng)曲線圖。熱效應(yīng)曲線圖的形成，是由于培養(yǎng)基含有多種成分，微生物則產(chǎn)生多種不同的代謝產(chǎn)物，以此表現(xiàn)出的熱效應(yīng)為多個曲線峰，如為單一營養(yǎng)成分，則只有一個峰出現(xiàn)?！≡诩毦L的過程中，用微量量熱計測量產(chǎn)熱量等熱數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機處理，繪制成以產(chǎn)熱量對比時間組成的熱曲線圖，以此推斷細菌存在數(shù)量。,微量量熱法,發(fā)射測量法,利用細菌在代謝碳水化合物時產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性標(biāo)記引入葡萄糖或其他糖類分子中

14、。細菌生長時，糖被利用并放出標(biāo)記的CO2，將生成的放射性標(biāo)記CO2從培養(yǎng)裝置中導(dǎo)出或用化學(xué)法吸收后，利用專用的放射測量儀來測定放射性CO2 。放射量與菌數(shù)成正比。,致病菌快速檢測方法,顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測法和PCR法為主。基因芯片,顯色培養(yǎng)

15、基法,原理　在選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上經(jīng)過改良?！±眉毦赜械纳砩磻?yīng)，使培養(yǎng)基中的指示劑產(chǎn)生顏色變化，以將目標(biāo)菌與其他菌區(qū)別開來,酶聯(lián)免疫技術(shù)—mini-Vidas全自動免疫分析儀,利用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標(biāo)生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標(biāo)本。優(yōu)點是檢測靈敏度高，速度快，可以在48小時的時間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李

16、斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。,分子生物學(xué)方法,基因探針法及PCR方法在國外已經(jīng)有相當(dāng)成熟的表現(xiàn)。有普通PCR，熒光PCR，實時熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结樂ㄒ话阋残枰鼍缓蠹犹结樤噭╇s交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進行擴增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。,優(yōu)缺點分子生物學(xué)方法檢測致病菌，特異性較強，技術(shù)較為