基于DNA芯片技術(shù)的微生物檢測方法研究.pdf

1、基因芯片可以實(shí)現(xiàn)生物樣本的高通量并行檢測，在基因表達(dá)譜檢測、基因多態(tài)性分析、疾病快速診斷、以及微生物檢測等方面有著廣泛的應(yīng)用。微生物快速檢測是傳染性疾病診斷和治療、食品衛(wèi)生和安全以及環(huán)境監(jiān)測的關(guān)鍵。細(xì)菌培養(yǎng)法、抗體檢測法等微生物檢測的經(jīng)典方法存在著培養(yǎng)周期長、某些微生物種群培養(yǎng)條件苛刻等問題，而且檢測通量低、質(zhì)量控制難?；蛐酒夹g(shù)為建立快捷高效的微生物檢測提供了全新的技術(shù)平臺。本論文以基因芯片技術(shù)為技術(shù)平臺，發(fā)展了4種新型的微生物檢測

2、方法：基于滾環(huán)擴(kuò)增(rollingcircling amplification，RCA)的基因突變檢測芯片技術(shù)、基于單熒光標(biāo)記的定量PCR檢測芯片技術(shù)、基于電化學(xué)的定量PCR檢測芯片技術(shù)以及新一代高通量DNA測序技術(shù)。
　　 1．基于滾環(huán)擴(kuò)增的基因突變檢測芯片技術(shù)。該技術(shù)設(shè)計(jì)了液相RCA核酸探針和固定檢測探針等二類核酸探針來并行地檢測微生物基因組上不同單堿基突變位點(diǎn)。液相RCA核酸探針包括四個(gè)片段區(qū)域：引物區(qū)、固定區(qū)、模板區(qū)和探

3、針區(qū)。當(dāng)探針兩端的序列與待檢序列嚴(yán)格互補(bǔ)時(shí)，在T4 DNA連接酶作用下連接成環(huán)。通用引物與探針引物區(qū)雜交延伸，在Φ29DNA聚合酶作用下等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)生一條長的單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)。擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在載玻片表面的固定探針雜交，同時(shí)通過與熒光探針雜交檢測基因突變位點(diǎn)。RCA探針上的探針區(qū)，可與通用的熒光探針雜交。本文應(yīng)用RCA擴(kuò)增芯片技術(shù)檢測了艾滋病病毒克隆文庫(c-DNA)的基因點(diǎn)突變。該方法能夠準(zhǔn)確地檢測出等主要的HIV病毒POL

4、，基因的變異位點(diǎn)K65R，V108I，M184V。RCA擴(kuò)增芯片結(jié)合了連接酶的高準(zhǔn)確性和基因芯片的高通量性的特點(diǎn)，在病毒基因點(diǎn)突變的高通量檢測方面有一定的應(yīng)用前景。
　　 2、基于單熒光標(biāo)記的定量PCR檢測芯片技術(shù)。該技術(shù)提出了一種新的能夠高通量定量檢測靶基因的生物芯片技術(shù)。在固定有若干單熒光標(biāo)記核酸探針的芯片表面上對靶基因進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，同時(shí)靶基因特異性地雜交結(jié)合在固定核酸探針上在Taq酶的作用下對探針上的熒光基團(tuán)進(jìn)行切割

5、，實(shí)現(xiàn)了在片多通量定量PCR檢測。根據(jù)PCR動(dòng)力學(xué)原理，推導(dǎo)出初始模板量與探針熒光衰減率之間的定量關(guān)系，繪制出芯片多重定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。本文對該芯片多重PCR體系優(yōu)化，提出了實(shí)時(shí)芯片熒光信號的修正方法。該技術(shù)采用了單熒光標(biāo)記的熒光探針，避免了TaqMan探針采用的熒光能量傳遞原理，降低探針的熒光背景，減少了芯片的制備成本。
　　 3、基于電化學(xué)的定量檢測芯片技術(shù)。本文提出了一種基于電化學(xué)檢測原理的DNA芯片定量檢測技術(shù)。將DN

6、A探針修飾到電極表面構(gòu)成DNA修飾電極，電極表面的DNA探針分子與靶序列進(jìn)行特異性雜交，形成雙鏈DNA，通過具有電活性的雜交指示劑來識別。利用氨基乙硫醇(AET)在金電極上組裝單分子層(SAM)，共價(jià)鍵合DNA分子固定到單分子層上，成功地制得DNA修飾電極。以[Co(phen)3](ClO4)3作為指示劑來檢測循環(huán)伏安曲線(CV)，通過CV峰值的變化和標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來估算待測基因的含量，從而進(jìn)行該種微生物的定量檢測。論文對單增李斯特氏菌中

7、編碼毒性因子LLO的基因Hly進(jìn)行檢測，通過CV峰值的變化和標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算樣品中Hly基因的含量來確定單增李斯特菌豐度，從而確定樣品中單增李斯特氏菌的污染情況。
　　 4、新一代高通量DNA測序技術(shù)。應(yīng)用SOLiD高通量DNA測序技術(shù)探索了微生物分布的檢測方法。即不通過微生物分離，直接通過微生物16SRNA基因測序，研究微生物的種群結(jié)構(gòu)。在提取微生物種群的總DNA后，制備整個(gè)種群的16SRNA基因文庫，然后進(jìn)行高通量的測序，

8、從整體上對樣品群落進(jìn)行分析。本文以鄱陽湖某一水域中細(xì)菌種群為研究對象，提取該地區(qū)的水樣中所有細(xì)菌的DNA；通過通用的16SRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用SOLiD測序平臺進(jìn)行DNA測序。為了保證樣本擴(kuò)增中DNA拷貝數(shù)的真實(shí)性，PCR循環(huán)次數(shù)為10次。對于SOLiD測序得到的大量短片段序列信息，采用了兩種方法進(jìn)行處理。一是把SOLiD測序得到的讀長35bp的序列先拼接成讀長50bp以上序列，然后再與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，確定這些細(xì)菌的種類及