核桃抗氧化肽的制備及其分離純化.pdf

1、核桃是一種營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值都非常高的食品，含有豐富的油脂和蛋白質(zhì)，在工業(yè)生產(chǎn)中常用作榨油用料，而含有大量蛋白質(zhì)的榨油餅粕目前對其的利用具有一定的局限性。為了充分開發(fā)利用核桃蛋白質(zhì)資源，提高核桃產(chǎn)品的附加價值，本文以核桃餅粕為原料利用蛋白酶酶解制備抗氧化活性多肽，并對所得的多肽混合物進行了分離純化，以期獲得具有較高抗氧化活性的小肽分子，進而對其結(jié)構(gòu)組成進行研究。主要研究結(jié)果如下：
　　(1)研究了核桃蛋白酶解制備核桃多肽的各種影響

2、因素，以核桃蛋白酶解液對DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除率為考察指標(biāo)，從四種商品蛋白酶中篩選出中性蛋白酶。采用單因素、正本文交試驗的方法對核桃蛋白酶解工藝進行了探討。通過試驗，得出最佳酶解工藝條件：酶解時間3h、加酶量為4％、溫度35℃、pH7.0、底物濃度2.5%，在此條件下所制備得的抗氧化肽對DPPH清除率可達到95.56%。
　　(2)酶解后的核桃蛋白提取液經(jīng)離心、超濾、凍干處理后，得到分子量主要集中在3KD以

3、下的核桃多肽粗品。并對核桃蛋白和多肽粗品的氨基酸含量和成分作了分析，結(jié)果表明：核桃蛋白和多肽粗品的氨基酸的種類基本一致，其中兩者均含有除色氨酸以外的7種必須氨基酸，而其中含量相對較高的氨基酸有精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。
　　(3)利用柱層析系統(tǒng)，依次采用了陰離子柱、陽離子柱和G25凝膠柱對核桃多肽粗品進行分離。通過試驗得到了具有較強DPPH清除能力的多肽組分，并確定了各層析柱的最佳分離條件。樣品液過陰離子交換柱的最佳條件為：洗脫液

4、0.6mol/lNaCl、 pH7、上樣濃度10mg/mL、流速10mL/min，選取抗氧化活性最高的A組分經(jīng)陽離子交換柱，其最佳分離條件為：洗脫液0.4mol/LNaCl、 pH7、上樣濃度5mg/mL、流速10mL/min，再選取抗氧化活性最高的H組分經(jīng)G25凝膠柱，其最佳分離條件為：上樣量1mL、上樣濃度約1mg/mL、流速0.5mL/min，得到I組分的抗氧化活性最高，在同等濃度下其對DPPH清除率較分離前、A組分、初始樣品液相

5、比分別提高了2.26%、4.87%和7.15%。I組分通過LC-MS/MS進行分析檢測，分子量范圍在713-1620Da之間，其含有15肽化合物的可能性較大，其肽段序列為：Phe-Val-Asp-Ser-Thr-Val-Val-Ala-Ser-Val-Thr-Ile-Ile-Asp-Arg。
　　(4)此外本文還探究了低濃度范圍下小分子多肽含量的測定方法，對雙縮脲法、考馬斯亮藍法及紫外分光光度法進行了對比分析，結(jié)果表明：考馬斯亮藍