大米蛋白抗氧化肽的制備、分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、大米蛋白質(zhì)具有高生物效價(jià)、低過(guò)敏性等重要特點(diǎn)，受到了全世界研究者的關(guān)注。我國(guó)目前還存在著大量不適于直接食用的早稻、碎米、庫(kù)存陳化米，以及工業(yè)消費(fèi)生成的米渣、米糟，可以提供豐富的大米蛋白資源?？寡趸?，作為一種天然抗氧化劑，具有強(qiáng)的抗氧化活性和高的安全性，引起了研究者的廣泛興趣。因此，充分開發(fā)利用大米蛋白制備抗氧化肽是重要的研究課題，具有一定的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
　　 本論文以秈米為原料，采用堿溶酸沉法提取得到大米蛋白濃縮物；采用不

2、同的蛋白酶酶解，篩選出水解大米蛋白的最佳酶源為中性蛋白酶；通過(guò)響應(yīng)面法分析優(yōu)化得到酶解大米蛋白制備抗氧化肽的最佳條件為：[S]5.0％、[E]/[S]2.3％、pH7.0、溫度37℃、時(shí)間4.2h，該條件下制備的大米蛋白抗氧化肽水解度(DH)為13.26％，對(duì)DPPH自由基(DPPH·)的清除率為60.54％。
　　 采用8種不同的體外抗氧化模型進(jìn)一步測(cè)定了大米蛋白酶解產(chǎn)物(NHREPs)的抗氧化活性，探討了不同的DH對(duì)NHRE

3、Ps抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，NHREPs的抗氧化活性與其水解度有關(guān)，DH為13％的NHREP是良好的電子供體和氫供體，能明顯抑制亞油酸體系的自動(dòng)氧化過(guò)程；具有較強(qiáng)的羥基自由基(·OH)及DPPH·清除能力，而清除超氧陰離子(O2-*)能力稍弱；同時(shí)具有很強(qiáng)的Fe2+螯合能力。進(jìn)一步測(cè)定不同水解度NHREPs的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：水解度為13％時(shí)，在500～1,020Da范圍的肽段含量達(dá)54.73％。
　　 經(jīng)SP

4、-Sephadex C-25、SephadexG-15和半制備的RP-HPLC分離純化NHREP(DH=13％)，篩選出抗氧化活性較強(qiáng)的肽組分F3b和F3c。采用MALDI-TOF/TOF MS法測(cè)得F3b和F3c的相對(duì)分子質(zhì)量分別為959.5和1002.5。結(jié)合TOF-MS/MS和氨基酸分析儀得出：F3b的一級(jí)序列為Phe-Arg-Asp-Glu-His-Lys-Lys(簡(jiǎn)稱為FRDEHKK)；F3c的一級(jí)序列結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)ys-His-A

5、sn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe(KHNRGDEF)。
　　 采用固相合成法Fmoc法合成FRDEHKK，進(jìn)一步驗(yàn)證合成FRDEHKK的抗氧化活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：FRDEHKK能夠抑制亞油酸體系的自動(dòng)氧化過(guò)程，其抑制效果強(qiáng)于α-生育酚；不同劑量的FRDEHKK對(duì)自由基的清除能力強(qiáng)弱順序依次為：·OH＞DPPH·＞O2-(·)。FRDEHKK的還原能力呈現(xiàn)出較強(qiáng)的量效關(guān)系；FRDEHKK對(duì)Fe2+的螯合能力接近于EDTA。推