海藻糖合酶基因轉(zhuǎn)化佛手citrusmedical.var.sarcodactylis方法的研究

1、 海藻糖合酶基因轉(zhuǎn)化佛手 ( C i t r u s m e d i c a L . v a r . s a r c o d a c t y l i s 方 法的 研究摘 要佛手， 學(xué)名。 t r u s m e d i c a L . v a r . s a r c o d a c t y l i s ， 為 蕓香 科柑桔屬香 椽的 變種。 它不 僅是是聞 香賞果的 花卉珍品， 又是傳統(tǒng)的名貴中藥。 我國

2、 佛手的主要栽培地區(qū)有廣東、 福建、四川、 浙江等， 其中 浙江金華所產(chǎn)的佛手品質(zhì)最為 優(yōu)良 ， 為佛手中的上品。 但其冬季不抗寒， 造成冬季大部分佛手受凍死亡， 嚴(yán)重影響佛手的品 質(zhì)和產(chǎn)量。 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展， 基因工程為解決這一問 題提供了 有效的方法和途徑。本試驗(yàn)同時(shí) 研究了 農(nóng)桿菌介導(dǎo)和基因 槍兩種遺傳轉(zhuǎn)化方法， 分別探討了兩種轉(zhuǎn)化方法的影響因素， 優(yōu)化了 轉(zhuǎn)化條件， 初步建立了 佛手 農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)， 確定了 影

3、響基因 槍轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)重要參數(shù)利用 P C R 技術(shù)檢測(cè)到 外源基因( T P S ) 的導(dǎo)入， 利用 G U S 報(bào)告基因 檢測(cè)到外源基因 在抗性愈傷組織中的表達(dá)。 為 遺傳轉(zhuǎn)化提供了分子生物學(xué)依據(jù)。主要結(jié)果如下:1 以 佛手葉片為外植體，篩選出 適宜佛手再生的 基本培養(yǎng)基為 M T ，以M T為基本培 養(yǎng) 基 ， 誘 導(dǎo) 愈 傷 組 織 配 方 : 附 加 激 素 為2 , 4 - D 1 . 5 m g L - t , N

4、A A 1 . 0 m g - L - 1 , 6 - B A 0 . 4m g - L “ ' ， 誘 導(dǎo) 頻 率 達(dá)9 8 . 1 % ， 分 化 培 養(yǎng) 基 : 附 加 激 素 6 - B A 5 m g L “ t 和I A A 0 . 5 m g L - 1 .2 通過對(duì)葉片預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、 侵染時(shí)間、 共培養(yǎng)時(shí)間、 抑菌素種類和濃度、延時(shí)篩選時(shí)間、不同 選擇壓等遺傳轉(zhuǎn)化影響因素的 研究， 建立的佛手遺傳轉(zhuǎn)

5、化體系為: 葉片黑暗預(yù) 培 養(yǎng)3 天， 菌 液 濃 度O D 6 0 為0 . 6 - 0 . 8 的 農(nóng) 桿菌 中 浸染2 0 分 鐘， 在附 加 物為L - c y s 4 0 0m g L - ' , A S l 0 0 1 u n o l L “ ‘ 誘 導(dǎo) 愈 傷 組 織 培 養(yǎng) 基 上 黑 暗 共 培 養(yǎng)3 天， 然 后 轉(zhuǎn) 移 至附 加 物 為2 5 0 m g . L “ ' C e f

6、, 2 5 0 m g . L - ' C b . 4 0 0 m g . L - ' L - c y s , A S 1 0 0 w t n o l . L ' 黑 暗 培 養(yǎng)2 - 4 天 ， 再 進(jìn)行K m 1 0 0 m g . L - ‘ 的 選 擇 壓 黑 暗 培 養(yǎng) 至 抗 性 愈 傷 組 織 出 現(xiàn) ， 轉(zhuǎn) 為 光 照 條 件 下1 - 2 次 的 繼代篩選，獲得抗性芽后，

7、 進(jìn)行擴(kuò)繁。3 取幼 嫩葉片， 用直 徑為 1 . O i u n金彈 轟擊葉 片， 在轟擊距離為 6 c m ， 轟擊壓力為1 I 0 0 p s i ， 真 空 度2 6 i n c h e s H g ， 恢 復(fù) 培 養(yǎng) 時(shí) 間 為4 8 小 時(shí) 左 右時(shí) 。 G U S 瞬 時(shí) 表 達(dá) 效 率 最高 達(dá) 1 7 . 8 % ，表達(dá)活性也最高。 轟擊次數(shù)對(duì)G U S 瞬時(shí)表達(dá)效率影響不明顯。4以 根癌農(nóng)桿菌L B A 4 4

8、0 4 介導(dǎo)T P S 基因 轉(zhuǎn)化佛手葉片， 獲得抗性愈傷組織。 對(duì)其O N T H E M E T H O D S OF T R A N S F O R MA T I O NW I T H T P S G E NE T O C I R T I I S ME D I C AL . V AR .ABS T R AC TC i t r u s m e d i c a L . v a r . s a r c o d

9、a c t y l i s i s a v a r i a t i o n o f F r u c t u s C i t r i w h i c h b e l o n g s t o C i t r u so f R u t a c c a e . I t i s n o t o n l y a c u r i o s a f o r i t s a r o m a a n d f r u

10、 i t , b u t a l s o a r a r e C h i n e s e t r a d i t i o n a lm e d i c i n e . I t i s m a i n l y c u l t i v a t e d i n G u a n g d o n g , F u j i a n , S i c h u a n a n d Z h e j i a n g p r o

11、 v i n c e . T h ef r u i t p r o d u c e d i n J i n h u a , Z h e j i a n g h a s t h e m o s t e x c e l l e n t q u a l i t y . B u t t h e p l a n t c a n n o t b e a rt h e c o l d i n w i n t e

12、r . A s a r e s u l t , t h e m a j o r i t y o f C i t r u s m e d i c a d i e d , a n d t h e q u a l i t y a n d q u a n t i t yo f t h e p l a n t w e r e i n f l u e n c e d s e v e r e l y . W i

13、 t h t h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f m o d e m b i o - t e c h n o l o g y ,g e n e - p r o j e c t p r o v i d e e f i c i e n t m e t h o d s a n d a c c e s s f o r r e s o l v i n g t h e p r

14、 o b l e m .A g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n a n d p a r t i c l e b o m b a r d m e n t w e r e s t u d i e d i n t h i ss t u d y . T h e f a c t o r s w h i c h i n f

15、l u e n c e t w o t r a n s f o r m a t i o n m e t h o d s w e r e d i s c u s s e d r e s p e c t i v e l y ,a n d o p t i m i z e d t r a n s f o r m a t i o n c o n d i t i o n s , W e p r i m a r i l y e

16、 s t a b l i s h e d A g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n s y s t e m， a n d s e v e r a l ~ p a r a m e t e r s i m p a c t i n g p a r t i c l e b o m b a r d m e n t w e r ec o

17、n f i r m e d . W e d e t e c t e d f o r e i g n g e n e i n t e g r a t e d i n t o e x p l a n t b y P C R t e c h n o l o g y , I n t h e m e a nt i m e , w e a l s o d e t e c t e d t h e t a r g e

18、 t g e n e t h a t h a d b e e n e x p r e s s e d i n b e r g a m o t ' s c a l l u sa c c o m p a n y i n g w i t h N P T I I g e n e b y G U S r e p o r t g e n e . I t p r o v i d e d t h e e v

19、 i d e n c e t h a t w a s u s e dm o l e c u l a r b i o l o g y f o r t r a n s f o r m a t i o n . T h e m a i n r e s u l t s w e r e a s f o l l o w s :1 . T a k i n g b e r g a m o t ' s l e a v e

20、 s a s e x p l a n t s , w e s e l e c t e d t h e s u i t e d r e g e n e r a t i o n b a s i c m e d i at h a t i s M T , t h e b e s t i n d u c i n g c a l l u s h o r m o n e c o m b i n a t i o n

21、i s 1 . 5 m g . L “ ' 2 , 4 - D , 1 . O m g . L - ' N A Aa n d 0 . 4 r n g . L “ 1 6 - B A . T h e i n d u c i n g f r e q u e n c y i s 9 8 . 1 p e r c e n t . t h e b e s t d i f e r e n t i a t i o

22、 nh o r m o n e c o m b i n a t i o n i s 5 m g . L - 1 6 - B A a n d O . 5 m g . L - ' I A A .2 . F a c t o r s t h a t i n f l u e n c e p e r c e n t a g e o f a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e