mir21和mir132在hepg2.2.15細胞中對慢性hbv感染和cmyc、pten基因表達的作用

1、碩士學(xué)位論文南方醫(yī)科大學(xué)2 0 1 5 級碩士學(xué)位論文m iR - 2 1 和m i R - 1 3 2 在H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞中對慢性H B V 感染和c - m y c 、P T E N 基因表達的作用T h e e f f e c to f m i R - 2 1a n d m i R - 1 3 2o n H B V i n f e c t i o na n dc - m y c ／P T E N e x p

2、 r e s s i o n i nH e p G 2 ．2 ．1 5c e l l s課題來源：廣州市科技計劃基金資助項目，N o ．2 0 1 3 J 4 1 0 0 1 1 6學(xué)位申請人導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學(xué)院答辯委員會主席答辯委員會成員林永敏任產(chǎn)i兒科學(xué)專業(yè)型碩士第一臨床醫(yī)學(xué)院年 月 日 廣州碩士學(xué)位論文m i R 一1 3 2 廣泛參與多種細菌、病毒感染和腫瘤致病過程。既往在免疫細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，m i R 一

3、1 3 2 對病毒感染主要起促進作用。m i R - 1 3 2 表達升高可抑制巨噬細胞中轉(zhuǎn)錄輔激活物p 3 0 0 ( t r a n s c r i p t i o n a l c o a c t i v a t o rp 3 0 0 ) 的表達，從而降低干擾素一y ( I F N —y ) 的表達。但在H B V 感染相關(guān)肝癌( H C C ) 中，m i R - 1 3 2的表達被H B x 抑制，且m i R 一1 3 2 表

4、達降低與H C C 的發(fā)展相關(guān)，提示m i R - 1 3 2 在H B V 感染中所起的作用可能與其在免疫細胞中不同。在H C C 中，有研究證實m i R 一1 3 2 能通過A k t ／m T O R 信號通路( A k t ／M t o r s i g n a l i n g p a t h w a y ) 和Y e s —a s s o c i a t e d p r o t e i n ( Y A P ) 抑制癌細胞增殖。

5、而P T E N 基因( p h o s p h a t a s e a n dt e n s i nh o m o l o gd e l e t e do n c h r o m o s o m e t e n ) 是A k t 信號通路上游作用因子之一，其表達降低是H C C 發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。T a r g e t s c a n 數(shù)據(jù)預(yù)測提示P T E N 基因是m i R 一1 3 2 的作用靶點之一。因此，進一步探討m i

6、 R - 1 3 2 在慢性H B V 感染中對H B V 復(fù)制、表達及P T E N 基因的表達所起的作用是本研究的另一方面。研究方法1 ．p m R 一2 1 和p m R - 1 3 2 真核重組過表達載體的構(gòu)建通過m i R B a s e 數(shù)據(jù)庫分別查找p r e —m i R 一2 1 ( m i R 一2 1 前體) 和p r e —m i R - 1 3 2( m i R 一1 3 2 前體) 序列及其上下游各l O O

7、 b p 側(cè)翼序列，用0 1 i 9 0 7 軟件設(shè)計引物。提取H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞的D N A 作為模板，用P C R 擴增前體序列。純化后的P C R 產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后分別和p m R —m C h e r r y 質(zhì)粒用T 4 連接酶于1 6 。C 過夜連接。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌D H 5 Q ，進行卡那霉素抗性平板篩選。1 6 小時后挑取陽性菌落進行菌落P C R 和搖菌擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行雙酶切

8、，以1 ％瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定重組載體正確性。最后選取電泳陽性組的菌株進行測序鑒定。2 ．重組載體轉(zhuǎn)染H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞和H e p G 2 細胞H e p G 2 ．2 ．1 5 細胞培養(yǎng)于含1 5 ％F B S 的高糖D M E M 培養(yǎng)液中( 同時添加2 0 0 m g ／L的G 4 1 8 、l Og ／L L 一谷氨酰胺以及1 0 0 0 0 0I U ／L 青鏈霉素) ，H e g G 2 細胞培養(yǎng)于