支氣管肺泡灌洗液及胸腔積液中mage-3 mrna的表達在良、惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值

1、胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液中胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液中胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液中胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液中MAGE3MAGE3MAGE3MAGE3mRNAmRNAmRNAmRNA的的的的表達在良、惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值表達在良、惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值表達在良、惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值表達在良、惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值※※※※劉靜，岳紅梅，呂燕蘭州大學第一醫(yī)院呼吸科，甘肅蘭州730000Email:ices200

2、501@摘要：摘要：摘要：摘要：目的目的：研究MAGE3基因mRNA在支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BLF）及胸腔積液（pleuraleffusion，PE）中的表達，并探討MAGE3基因作為良、惡性胸腔積液鑒別診斷指標的可能性。方法方法：采用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（nRTPCR）方法，檢測35例患者（25例惡性，10例良性）胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液中的MAGE3表達的情況。結果結果：良性胸腔

3、積液患者組中，胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液中的MAGE3表達均為陰性。惡性胸腔積液患者組中，胸腔積液中MAGE3表達的陽性率為56％，而支氣管肺泡灌洗液中MAGE3表達的陽性率為76％；其中2例患者胸腔積液中MAGE3基因表達陽性，支氣管肺泡灌洗液中表達陰性，7例患者支氣管肺泡灌洗液中MAGE3基因表達陽性，胸腔積液中基因表達陰性；而12例患者胸腔積液和支氣管肺泡灌洗液中MAGE3基因表達均為陽性。聯(lián)合檢測胸腔積液和支氣管肺泡灌洗液中MA

4、GE3基因的表達陽性率為84％，較單一檢測胸腔積液中基因表達率提高，且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0310.05）。結論結論：聯(lián)合檢測胸腔積液及支氣管肺泡灌洗液中MAGE3基因mRNA的表達，可以作為鑒別良惡性胸腔積液的一個指標。關鍵詞：關鍵詞：關鍵詞：關鍵詞：肺癌；MAGE3基因；胸腔積液；支氣管肺泡灌洗液；巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應中圖分類號中圖分類號中圖分類號中圖分類號R7342引言引言胸腔積液是一種常見臨床征象，臨床上可分為漏出液和滲

5、出液。漏出液大多數(shù)是由良性疾病引起的，常見的病因為充血性心力衰竭、肝硬化、腎病綜合征。滲出液最常見的病因為惡性腫瘤、結核性胸膜炎、細菌性肺炎。其中，結核性胸腔積液和惡性胸腔積液發(fā)病率較高，鑒別十分困難。此外胸腔積液的診斷與治療、預后密切相關。目前，臨床上常見的鑒別方法是脫落細胞檢查找癌細胞，但其陽性率不高，易導致漏診。因此，目前尚需一種敏感、特異、方便的方法來鑒別良惡性胸腔積液。黑色素瘤抗原(melanomaassociatedanti

6、genMAGE)是Van等[1]于1991年在黑色素瘤細胞系中首次發(fā)現(xiàn)，是一種新的腫瘤特異性抗原(tumspecificitiedantigenTSA)。MAGE基因通常只在睪丸、胎盤[2][3][4]等少數(shù)正常組織中表達，而在多數(shù)腫瘤組織中有異常高※本研究受甘肅自然科學基金暨中青年科技項目（3ZS051A25082）資助1:www.paper.1.1.4主要儀器1.1.4主要儀器B160A型醫(yī)用低速離心機、Heraeus離心機（德國）

7、、熱循環(huán)儀、DYY6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、WFH201B紫外反射投射儀、Kodak凝膠圖象分析儀、超低溫冰箱、紫外型超純水儀、HCTP112架盤藥物天平、TN100B型托盤扭力天平、電熱恒溫水溫箱、LGWD700型微波爐、LX100手掌型離心機。1.2MAGE3基因mRNA表達的測定1.2.1標本的采集及總RNA的提取1.2MAGE3基因mRNA表達的測定1.2.1標本的采集及總RNA的提取用高壓滅菌并加有EDTA的250ml鹽水瓶收集胸

8、腔積液200ml，另抽100ml送病理科行細胞學檢查。將標本立即離心（1500g，10分鐘；PBS緩沖液沖洗兩次，1500g5分鐘），棄上清獲得沉淀，沉淀中加1mlTrizol(上海生工)裂解液，經(jīng)氯仿分層，等體積異丙醇沉淀，75％乙醇洗滌，室溫干燥，0.1％的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳分析。1.2.2cDNA的合成1.2.2cDNA的合成20μl反應體系加入3.5μl總RNA、隨即引物1μl、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1

9、μl、RNasin1μl等，37℃水浴60分鐘，所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于－70℃超低溫冰箱備用。（參照上海生工AMV逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應試劑盒說明書操作）1.2.3MAGE3基因的PCR擴增（1.2.3MAGE3基因的PCR擴增（50505050μμμμllll反應體系）反應體系）第一輪PCR擴增:5μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加入0.5μlTaqDNA聚合酶，擴增片段長度為423bp于PCR熱循環(huán)儀中擴增30個循環(huán)（95℃60s，56℃30s，

10、72℃30s）72延伸10分鐘。第二輪PCR擴增：5μl第一輪PCR擴增產(chǎn)物，加入0.5μlTaqDNA聚合酶，擴增片段長度為235bp于PCR熱循環(huán)儀中擴增40個循環(huán)（95℃60s，56℃30s，72℃30s）72延伸10分鐘。引物序列見表1。1.2.51.2.5PCRPCRPCRPCR產(chǎn)物電泳產(chǎn)物電泳取PCR產(chǎn)物10μl，經(jīng)溴化乙啶染色，GM331(LowMWDNA)作為Marker進行2%瓊脂糖凝膠電泳，Kodak凝膠圖象分析儀分