現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗學(xué)_pcr技術(shù)原理及其應(yīng)用

1、PCR技術(shù)原理及PCR儀的應(yīng)用,§1 PCR技術(shù)原理§2 PCR儀的技術(shù)應(yīng)用,,第一節(jié) PCR技術(shù)原理,一、 PCR技術(shù)簡史,一、 PCR技術(shù)簡史,Kary B. Mullis,>,1989年美國《Science》雜志列PCR 為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。,,,二、PCR的基本原理,DNA的復(fù)制又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),,變成兩條單鏈DNA,

2、,,,二、PCR的基本原理,DNA的復(fù)制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明,,引物酶,引物酶,,,二、PCR的基本原理,DNA的復(fù)制聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明,,DNA聚合酶,DNA聚合酶,,二、PCR的基本原理,類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,,DNA的復(fù)制又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),,首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈,將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火,使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸,這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個

3、PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。,降溫,升溫,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC),Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意圖,①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；,PCR Cycle - Ste

4、p 2 – Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5’,3’,5’,5’,3’,5’,3’,3’,②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的堿基序列配對結(jié)合；,PCR Cyc

5、le - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5’,3’,5’,5’,3’,5’,3’,3’,Taq DNAPolymerase,③引物的延伸：

6、DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（各種核苷酸）為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的DNA 鏈。,End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因放大幾百萬倍。,72

7、℃,,94℃,55℃,,,,,,PCR循環(huán),No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32

8、 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,,,,,,,,,,,,,,高效的DNA分析技術(shù),PCR儀,三、普通PCR反應(yīng),,普通PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,,,,,,,,,重復(fù)1~3步25~30輪,目的DNA片段擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復(fù)性,DNA變性形成2條單鏈,子鏈延伸DNA加倍,模板DNA,,PCR的

9、基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,引物1,引物2,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,第1輪結(jié)束,第2輪開始,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,,,,,,,,,,Taq,Taq,Taq,Taq,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點

10、,,,,,,,,,,,,第2輪結(jié)束,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,,模板DNA,第1輪擴增,第2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴增,理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù),Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),,,,酶活性(%),溫度(℃),,,,,,,,,,,,,40 50

11、 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,,普通PCR反應(yīng),PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點,,普通PCR反應(yīng),（一）普通PCR反應(yīng)成分,（1）模板 單、雙鏈DNA均可（cDNA，逆轉(zhuǎn)錄而來，自行得到)。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。,（2）引物濃度

12、 0.1-0.5 ?mol/L 濃度過低影響產(chǎn)量，偏高引起錯配和非特異性產(chǎn)物增加，且可增加引物二聚體的產(chǎn)生幾率。,直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁。 如：http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer; http://frodo.wi.mit.edu/引物設(shè)計軟件，其中以“Oligo 6”和“ Premier5.0”最為優(yōu)秀。首先是引物分析評價功能，

13、其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點不同。,（一）引物設(shè)計的方法,PCR引物的設(shè)計,（二）一般原則①引物長度在15～30堿基。引物過短，會使特異性降低。過長會提高相應(yīng)的退火溫度，且合成引物的成本增加。②引物中堿基的分布是隨機的，避免4個以上的嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C含量宜在 45～55％左右。,PCR引物的設(shè)計,③避免兩引物間的互補，特別是3‘端互補，以免形成二聚體。④引物自身不應(yīng)存在連續(xù)超過3bp的互補

14、序列， 否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身變性。,⑤引物的3’端不能有任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。⑥引物的5’端限定著PCR產(chǎn)物的長度，可根據(jù)產(chǎn)物的要求不同， 可以選用不同的引物修飾法。,⑦引物與非擴增序列的同源性不應(yīng)超過70％。,（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。,（4）dNTP (四種

15、核苷酸，提供堿基） 20~200μmol/L dNTP濃度取決于擴增片段的長度 四種dNTP濃度應(yīng)相等 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量，但特異性增加 dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2

16、+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。,10~50mmol/L Tris-Cl 緩沖液，72℃ 時pH 7.2,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。緩沖液含50 mmol/L的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入適量二甲基亞砜或甲酰胺有利于

17、破壞模板的二級結(jié)構(gòu)。,（6） PCR反應(yīng)的緩沖液,（二）普通PCR的循環(huán)參數(shù)：（1）變性 94oC~95oC，30-60 s 且最初在加Taq酶之前先于97oC充分變性5~10min（2）退火 50oC~55oC，60-90 s 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。,（3）延伸 70oC~74oC，60-120 s 延伸時間由擴增片段長度

18、決定（4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模板DNA的濃度，一般為25-35次 次數(shù)過多：非特異擴增增加。,最后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存產(chǎn)物。,上述參數(shù)均在PCR儀上進(jìn)行設(shè)置,（三）PCR產(chǎn)物,在PCR反應(yīng)中，DNA擴增過程遵循酶的催化動力學(xué)原理。反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，擴增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，又稱“平臺期”。到達(dá)平臺期所需

19、PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競爭等因素。到達(dá)平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進(jìn)行25次以上PCR循環(huán)。 多數(shù)情況下，平臺期在PCR反應(yīng)中不可避免。,PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖,30個循環(huán)最適宜,,（四）普通PCR的產(chǎn)物的檢測,瓊脂糖凝膠電泳 是PCR擴增產(chǎn)物的分離、純化和鑒定最常用的方法。其分辨率很高，可測出1ng DNA。一般800bp以上的片段用0

20、.8%的膠，800bp以下的片段用1.0%～2.0%的膠。,PCR 產(chǎn)物1 %瓊脂糖凝膠電泳,凝膠分析成像系統(tǒng)照相掃描并進(jìn)行密度分析（如圖所示）。,,為了確定PCR產(chǎn)物是否是預(yù)先設(shè)計的目的片段，或產(chǎn)物是否有突變，都需做分子雜交檢測。分子雜交包括點雜交和Southern印跡雜交。點雜交靈敏度較高，特別適用于特異性不高的PCR擴增產(chǎn)物分析。 Southern印跡雜交可鑒定PCR產(chǎn)物的大小和特異性，檢測靈敏度可達(dá)10ng?；?/p>

21、本過程是PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，然后，印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交檢測。,分子雜交,（五）普通PCR反應(yīng)中應(yīng)注意的事項,（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及Ep管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對照：陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板試劑對照：除模板外的所有組分,（六）普通PCR反應(yīng)中常見問題,無擴增產(chǎn)物非特異性擴增拖尾假陽性,（七）普通PCR反應(yīng)缺點,a.只能對終產(chǎn)物進(jìn)行分

22、析，無法對起始模版準(zhǔn)確定量b.必須在擴增反應(yīng)結(jié)束后借助電泳方法分析，費時費事c.無法對擴增反應(yīng)實時檢測d.EB(核酸染料，在電泳時使用）有毒,real-time PCR， FQ-PCR，美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在普通PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實現(xiàn)其定量功能的，與普通PCR相比，實時定量PCR具有許多優(yōu)點。,四、實時熒光定量PCR,,實時熒光定量PCR：利用熒光

23、信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值（循環(huán)數(shù)）和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板進(jìn)的定量分析。,PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，探針的5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基團FAM（熒光發(fā)射峰值在518nm處），靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團TAMRA（熒光發(fā)射峰值在582nm處）。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解

24、，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。,（一）實時熒光定量PCR原理和方法,熒光發(fā)射基團,熒光淬滅基團,,Taq酶,,,,每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號與基因拷貝數(shù)成正比,,,IQ5 Real-time PCR儀,循環(huán)數(shù)，ct值,熒光強度,隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增

25、加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，得到一條熒光擴增曲線圖,實時熒光定量PCR三個關(guān)鍵詞： 實時，熒光，定量 如何實時檢測？？？ 借助熒光物質(zhì)示蹤擴增產(chǎn)物量的變化,如何對起始模板定量？ 通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析 引入兩個概念： 熒光閾值、Ct值,熒光閾值,在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個熒光強度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)),閾值線,熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一

26、個值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴增階段任意位置上，默認(rèn)設(shè)置一般是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。但實際應(yīng)用時要結(jié)合擴增效率、線形回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮,Ct值的概念,Ct值的定義是PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物(熒光信號）到達(dá)閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù),閾值線,模板起始濃度越高，Ct值越小,CT值與模板起始濃度的關(guān)系,哪個樣品濃度高？,普通PCR終點處檢測產(chǎn)物量不恒定；Real-time PCR利用Ct的概念，在指數(shù)擴增的開始階段進(jìn)

27、行檢測，此時樣品間的細(xì)小誤差尚未放大，因此該Ct值具有極好的重復(fù)性。,定量原理,理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n 非理想的PCR反應(yīng)： X=X0(1+Ex)n n：擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴增效率,,（二）實時熒光定量PCR反應(yīng)體系,SYBR Green 1染料,TaqMan探針,熒光化學(xué),SYBR Green 1（綠色熒光染料）,（三

28、）SYBR Green I 工作原理,SYBR Green 1 結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量,,,Extension,Extension ContinuedApply ExcitationWavele

29、ngth,,Repeat,A 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA溶液按101，102，103，104，105進(jìn)行梯度稀釋，以不同稀釋度的cDNA為模板擴增目的基因和看家基因，以相對起始濃度和Ct值（循環(huán)閾值）為X、Y軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。B 配制反應(yīng)體系,,以檢測c-fos基因為例：,引物：c-fos-forward 5'-TGATACACTCCAAGCGGAGAC-3'c-fos-reverse 5'-

30、CCCAGTCTGCTGCATAGAAGG-3'GAPDH-forward 5'-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3'GAPDH-reverse 5'-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3‘循環(huán)參數(shù)：95℃ 10s 預(yù)變性，然后94℃ 40s，60℃ 40s，72℃ 40s 共60個循環(huán)。,c-fos real-time PCR,擴增曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線,融解曲線,SYBR Gree

31、n 1這種非特異性結(jié)合 dsDNA 的染料，也可能和反應(yīng)中的引物二聚體非特異性結(jié)合，而釋放熒光信號，會導(dǎo)致儀器檢測的信號不僅僅是目的基因的，所以需要在反應(yīng)結(jié)束后設(shè)定一個升溫過程，然后慢慢把溫度降下來，因為不同DNA片段的解鏈溫度不同，這時若PCR產(chǎn)物純，則只會出現(xiàn)一個熒光峰，因為只有一個溫度值，若有雜質(zhì)，則會出現(xiàn)其他峰值，這是一個特異性檢測方法。,融解曲線參數(shù)(dsDNA的解鏈溫度Tm值）：72-95℃, 第一步持續(xù)時間為45s, 接

32、下來每步持續(xù)時間為5s。,評價產(chǎn)物是否純,在qPCR循環(huán)反應(yīng)結(jié)束之后，系統(tǒng)會進(jìn)行測定融解曲線，通常的方式就是從70度加熱到90度，然后每隔一定時間（1s或者少于1s）測定系統(tǒng)熒光強度，隨著溫度的升高，dsDNA都解開雙鏈，SYBR Green都游離之后不發(fā)熒光，熒光逐漸下降。那么畫出來一個個熒光強度和溫度的曲線,融解曲線,c-fos real-time PCR,隨著溫度上升，達(dá)到圖中Tm點時，大部分?jǐn)U增出來的雙鏈DNA解開

33、，熒光值下降非?？臁Ｈ绻鹮PCR產(chǎn)物非常特異那么，融解曲線在80-90之間會形成一個單峰(溫度和qPCR產(chǎn)物長度以及GC含量相關(guān)）,溫度,dR/dT,熒光強度對溫度求導(dǎo),評價產(chǎn)物特異性： 使用融解曲線分析（ Melt Curve Analysis） 評價引物對擴增效率： 將模板進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)行絕對定量： 使用擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用方便 --- 不必設(shè)計復(fù)雜的熒光探針 沒有序列特異性

34、 --- 可以用于不同的模板 便宜 靈敏,（四）SYBR Green I優(yōu)點,與非特異性產(chǎn)物結(jié)合無法實現(xiàn)多個目的基因的檢測,,（五）SYBR Green I缺點,TaqMan,探針,熒光素,淬滅劑,TaqMan,（六）TaqMan探針的工作原理,TaqMan,水解型、具有目標(biāo)特異性的探針 5’為熒光素， 3’為淬滅劑,與目標(biāo)序列互補,,,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase

35、,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation（變性）,,Annealing（退火）,Reaction Tube,,TaqMan工作原理,,,Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. PolymerizationComplete,4. Detection,l,,,,TaqMan工作原理,對目標(biāo)序列有很高的特異性

36、 ---特別適合于SNP檢測可以實現(xiàn)多通道檢測 設(shè)計相對簡單,（七）TaqMan探針優(yōu)點,價格較高 只適合于一個特定的目標(biāo) 不能進(jìn)行融解曲線分析 背景高,（八）TaqMan探針缺點,（九）熒光探針設(shè)計遵循原則探針長度應(yīng)在20～40個堿基左右，保證結(jié)合特異性。GC堿基含量在40%～60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。避免與引物發(fā)生雜交或重疊。探針與模板結(jié)合穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值（

37、DNA熔解溫度）要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結(jié)果有影響。,FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應(yīng)用，可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點。FQ-PCR只須在加樣時打開一次蓋子，其后的過程完全是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了普

38、通PCR操作中的諸多弊端。,五、實時熒光定量PCR的特點,,六、PCR技術(shù)應(yīng)用,研究基因克隆，DNA測序，分析突變診斷細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達(dá)圖譜法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析腫瘤各種腫瘤檢測其他……,1 病原體測定由于PCR技術(shù)的問世，使得病原體檢測能夠快速而方便的進(jìn)行。但由于其高靈敏性，實驗操作很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴增即可為陽性結(jié)果，但

39、并不能作為診斷依據(jù)，只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時才有臨床意義，因此結(jié)模板定量顯得特別重要。常規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應(yīng)用，然而PE公司研制的FQ-PCR技術(shù)給解決這一問題提供了可能。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于丙肝病毒、人類乳頭瘤病毒、結(jié)核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測研究。 　　Morris等用FQ-PCR對黑猩猩丙型肝炎動物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進(jìn)行了研究。FQ-PCR技術(shù)在保持巢式PCR高度敏感性的

40、同時又能提高效率，因此可作為一種檢測HCV的有效方法。同時，由于FQ-PCR可以測出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)。,以前常規(guī)檢測大腸桿菌的方法，都因為繁瑣，需要大量的PCR后處理過程及不能對標(biāo)本定量而受到限制。美國Witham等1996年將FQ-PCR技術(shù)應(yīng)用于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測研究。針對不同血清變異型的大腸桿菌，他們設(shè)計應(yīng)用不同的探針，從而提高了實驗特異性。,2. 腫瘤研究　　意大利Ge

41、lmini等用FQ-PCR技術(shù)檢測乳腺癌標(biāo)本c-erbB-2基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以β-肌動蛋白基因為參照探索最佳實驗條件，當(dāng)擴增循環(huán)數(shù)在28～31之間時，△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關(guān)系。他們在此條件下擴增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)△RQ都與各自的模板DNA濃度存在著線性關(guān)系，雖然二者斜率不同，但是各個實驗濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。他們將實驗數(shù)據(jù)與Sou

42、thern印跡結(jié)果和已報告的競爭性PCR結(jié)果比較都顯示高度相關(guān)性（n=25，r=0.94，P〈0.01）。,3. 基因表達(dá)研究　　　由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應(yīng)用，對mRNA的檢測顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準(zhǔn)確得多。為了探測骨髓基質(zhì)血小板生成因子（TPO）在巨核細(xì)胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在特發(fā)性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血（AA）和特發(fā)性血小板多癥（E

43、T）等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒在ABI7700反應(yīng)系統(tǒng)測定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法測定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結(jié)果顯示ITP和AA病人TPO mRNA水平明顯升高，而ET病人的TPO mRNA水平則正常，經(jīng)類固醇治療后ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其 mRNA水平有相關(guān)性；在正常人和I

44、TP病人，TPO mRNA表達(dá)水平與巨核細(xì)胞計數(shù)也有相關(guān)性。這個實驗對闡明TPO 的作用提供了依據(jù)。,4. 免疫組份分析　 對免疫T細(xì)胞群體V-β組份進(jìn)行分析是研究健康和疾病免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要手段，可通過流式細(xì)胞法或RFQ-PCR法來進(jìn)行。1997年Lang等用FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行實驗，他們在反應(yīng)系統(tǒng)中引入熒光探針，將下游引物與探針固定，然后，針對不同的V-β成份，選用特異的上游引物進(jìn)行擴增，再對反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號進(jìn)行處理，即

45、可獲得各個成份的數(shù)據(jù)。,5. 基因突變及多態(tài)性的研究　　美國Ibrahim等1997年用FQ-PCR技術(shù)對正常痘病毒多態(tài)性進(jìn)行了研究。他們采用一對可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結(jié)合的引物，并設(shè)計兩個有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標(biāo)記后進(jìn)行實驗，順利地把有此單核苷酸差異的兩個痘病毒株進(jìn)行鑒定。該技術(shù)也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態(tài)的研究。,6. 其他方面　　 日本Isono利用FQ-PCR進(jìn)行葉綠體成熟

46、度與其基因組拷貝數(shù)關(guān)系的研究。他們以核基因Cab作為內(nèi)參照，進(jìn)行葉綠體基因rbc1拷貝數(shù)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子葉出現(xiàn)以后，葉綠體基因拷貝數(shù)顯著增加，進(jìn)而把葉綠體的基因拷貝數(shù)增加與光誘導(dǎo)的葉綠體成熟過程聯(lián)系起來。1998年美國Higgins等還建立起一套用熒光探針檢測鼠疫纖溶酶原激活基因（pla）的實驗方法。,綜上所述，F(xiàn)Q-PCR作為一種核酸定量技術(shù)，應(yīng)用較多且較成熟的主要是在病原體檢測方面，其優(yōu)越性在此方面也得以充分體現(xiàn)。因此將該項技術(shù)進(jìn)一