血清學(xué)診斷在結(jié)核病中的臨床應(yīng)用價值

1、Clinical Applications of Serological Diagnostics in Tuberculosis血清學(xué)檢測在結(jié)核病中的診斷價值,,結(jié)核病的歷史,結(jié)核病的今天,全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化結(jié)核病與艾滋病同時流行結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象益發(fā)嚴(yán)重人口大規(guī)模流動我國是世界上僅低于印度的第二結(jié)核病大國結(jié)核菌感染率44.5%新發(fā)活動性結(jié)核患者130萬/年死亡13萬/年早期快速診斷與治療成為制約結(jié)核病控制的

2、關(guān)鍵常規(guī)實驗室診斷結(jié)核病方法陽性率不到60%,,結(jié)核病的數(shù)字,,全世界約1/3的人口（近20億）攜帶結(jié)核菌。自1882年以來已經(jīng)有2億人死于結(jié)核病。每年有2000萬人患活動性結(jié)核病。每年約有300萬人死于結(jié)核病。結(jié)核病每15秒鐘就殺死1人。預(yù)計未來20年還將有3600萬人死于結(jié)核病。,結(jié)核分枝桿菌,結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis),生物學(xué)主要特點：1. 細胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫

3、3.抗酸染色陽性,實驗室檢查方法的歷史,1880sTubercle bacilli的發(fā)現(xiàn) Ziehl-Neelsen染色方法1900sMantoux test (TST with tuberculin)1920sPetragnani medium Purified Protein Derivative（PPD）1930sLewenstein-Jensen 培養(yǎng)基1940sDu

4、bos agar, Ogawa 培養(yǎng)基1950sMiddlebrook 7H91990s核酸擴增方法2000sELISPOT, QuantiFERON20XX?????,當(dāng)前結(jié)核研究的熱點,新型抗結(jié)核藥物(50%)新型快速診斷技術(shù)(40%)新型結(jié)核疫苗(10%),結(jié)核病的實驗室診斷,細菌學(xué),涂片：敏感性低,傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：所需時間長，2~3月,分子生物學(xué),TB-DNATB-RNAHAIN技術(shù)Xpert MTB

5、/RIFDNA微陣芯片,血清/免疫學(xué),IGRA：有望替代TST，但不能區(qū)分活動性TB與潛伏感染,血清學(xué)：存在抗原純度和特異性差等方面的問題,,液體培養(yǎng)及藥敏試驗：平均時間20天,,血清學(xué)診斷技術(shù),血清學(xué)診斷技術(shù)優(yōu)勢：是一種對疾病進行早期診斷的理想方法。無需活細胞培養(yǎng)和特殊儀器設(shè)備操作簡便結(jié)果顯示快速目前用于血清學(xué)診斷的主要方法:酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELlSA)斑點金免疫滲濾法(DIGFA)免疫印跡法(Western Blo

6、tting)等等,脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原,脂阿拉伯甘露聚糖是分枝桿菌細胞壁的重要組成部分，是屬特異性抗原，具有較強的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，可刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因而是結(jié)核病的血清學(xué)診斷應(yīng)用較廣的抗原。有關(guān)LAM抗原的應(yīng)用報道很多, Antunes等用美國生產(chǎn)的結(jié)明(MycoDot TM)試劑盒檢測活動性肺結(jié)核病人的敏感性為63.0%，特異性為92.4%，認為檢測LAM抗體是結(jié)核病一項有效的輔助診斷方法。,A60(anti

7、gen 60),A60是從牛分枝桿菌胞漿中提取的一種大分子物質(zhì)，是脂質(zhì)蛋白和多糖的復(fù)合抗原。Wu等用ELISA法檢測了178例活動性肺結(jié)核患者和151例其他疾病患者血清中的IgG A60，根據(jù)受試者工作特性曲線(ROC)取261.2單位為截切值(cutoff point)，其敏感性和特異性分別為49.4%和79.5%，認為胸部X片異常的患者結(jié)合IgG A60陽性將有助于肺結(jié)核病的準(zhǔn)確臨床診斷。,結(jié)核菌糖脂(TBGL)抗原,結(jié)核菌糖脂抗

8、原是分枝桿菌細胞壁上的糖脂類物質(zhì)，具有菌屬特異性。近年來的研究表明，糖脂類抗原在診斷方面有很大的優(yōu)勢。Maekura等建立了糖脂類抗原抗體快速檢測方法，并做了臨床評價，對痰涂片陰性的活動性肺結(jié)核的靈敏度為56.8％，對痰培養(yǎng)陰性的活動性肺結(jié)核的靈敏度為51.2％。將TBGL與核酸擴增方法(NAA)聯(lián)合用于檢測，檢出率比兩者單獨使用時進一步提高。Tiwari等用脂質(zhì)體顆粒作為載體，利用純化的TBGL抗原特異的與結(jié)核病患者血清中的TBGL

9、抗體結(jié)合，形成藍色凝集顆粒來診斷活動性結(jié)核病，其敏感性、特異性分別達94%和98.3%。該方法快速(4min)、經(jīng)濟，且可以區(qū)別活動性肺結(jié)核、卡介苗(BCG)免疫接種者與健康人群，可用于人群大規(guī)模篩選肺結(jié)核病人。,38kDa蛋白,38kDa蛋白是一定位在質(zhì)膜上的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，只在分枝桿菌復(fù)合體中表達，BCG合成38kDa蛋白的量僅為結(jié)核分枝桿菌的十分之一。38kDa 蛋白為一分泌蛋白，可刺激T細胞和B細胞免疫反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于結(jié)核病

10、的血清學(xué)試驗。英國公司生產(chǎn)的OMEGA結(jié)核抗體定量檢測Myco G、A、M試劑盒聯(lián)合應(yīng)用38kDa和脂多糖(LPS)抗原，而TB Complex Plus試劑盒選用的是38kDa和16kDa抗原。Butt等對OMEGA試劑盒進行了評價，認為具有種特異性的TB Complex Plus和有屬特異性的Myco M聯(lián)合應(yīng)用可取得最好的效果，檢測肺結(jié)核的敏感性和特異性分別為87%和93%。38kDa對活動性肺結(jié)核的診斷非常有效，但和大腸埃希

11、菌同源蛋白有 30%以上的交叉，所以對不同人群的靈敏度波動較大，尤其對涂片陰性和合并HIV感染的結(jié)核病患者效果較差。,Ag85 抗原85復(fù)合體(Ag85),是一組具有較強細胞免疫及體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白，分子量約為30～32kDa。分枝桿菌各菌株均可分泌Ag85。結(jié)核分枝桿菌Ag85中至少包括三種蛋白成分—Ag85A、Ag85B和Ag85C，其中有免疫作用的主要為Ag85A和Ag85B。Ag85具有分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶的活性，在分

12、枝桿菌細胞壁合成的最后階段發(fā)揮必要的作用。它還能和人纖連蛋白(FN)相結(jié)合，有助于結(jié)核菌入侵宿主細胞。Ag85可能發(fā)展成為結(jié)核病的血清學(xué)診斷抗原?；顒有越Y(jié)核病人血清中的Ag85抗體平均水平比其他分枝桿菌疾病患者和健康對照者高50～150倍，可通過檢測血循環(huán)中Ag85抗體，對活動性結(jié)核加以診斷。Kashyap等用間接ELISA法檢測89%疑似結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中存在Ag85抗體，認為檢測Ag85抗體為結(jié)核性腦膜炎的早期和確定性診斷提

13、供了一個更靈敏的選擇。,ESAT-6和CFP10,ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原，是從結(jié)核分枝桿菌短期培養(yǎng)濾液中分離純化出的一種低分子量分泌性蛋白，具有較強的細胞免疫活性，在抗結(jié)核感染的免疫回憶應(yīng)答中起重要作用。ESAT-6僅存在于致病性分枝桿菌中，包括人型結(jié)核桿菌、牛型結(jié)核桿菌、非洲分枝桿菌以及蘇爾加分枝桿菌、海水分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等非典型分枝桿菌，而BCG及其他非致病性分枝桿菌缺失。CFP-10即培養(yǎng)濾液蛋白10，與

14、ESAT-6位于同一基因簇上，兩者分布相同，都是RDl區(qū)編碼的。ESAT-6和CFP10能刺激機體產(chǎn)生特異性IgG，利用ESAT-6和CFP10蛋白抗原能與結(jié)核分枝桿菌感染者血中特異性 IgG結(jié)合的特點，采用ELISA等方法可特異性區(qū)分是真正的結(jié)核分枝桿菌感染或是接種BCG后所致敏，該方法明顯優(yōu)于PPD作包被抗原的ELISA法。陳全等以CFP10-ESAT-6融合蛋白為抗原，用ELISA法檢測豚鼠血清中抗結(jié)核分枝桿菌抗體，11份H37

15、Rv感染豚鼠血清全部呈陽性反應(yīng)，11 份BCG免疫豚鼠血清僅1份呈陽性反應(yīng)。,U1蛋白,Mukherjee等收集結(jié)核分枝桿菌H37Rv株靜脈感染C57BL/6小鼠早期(10～14d) 尿液分離到一種結(jié)核抗原，氨基酸測序鑒定后，克隆并表達相應(yīng)的基因，純化得到可溶的重組蛋白命名為U1蛋白(Urine Protein 1)，分子量大約為16.8kDa。進一步用ELISA法檢測肺結(jié)核病人血清中U1抗體的敏感性為60%，檢測合并HIV感染的結(jié)核

16、病患者其敏感性為 87%，而正常人血清不與U1蛋白反應(yīng)。將U1蛋白與Mtb81聯(lián)合用于檢測合并HIV感染的結(jié)核病患者的敏感性為93.6%。同時檢測了12名HIV感染的非結(jié)核病人，其中9名患者血清中無可檢測的U1抗體，另外3名U1抗體的水平處于ELISA法檢測的臨界點。因此認為，檢測U1抗體可增加結(jié)核病血清學(xué)診斷的敏感性，尤其對合并HIV感染的結(jié)核病患者。,其它抗原,Weldingh等在大腸埃希菌中克隆表達了4種超抗原—TB9.7、TB

17、15.3、TB16.3和TB51，并用它們來檢測痰涂片陽性和涂片陰性的結(jié)核病人，靈敏度為36%～93%，而特異性超過97%，其中TB16.3最為有效，TB16.3與TB9.7聯(lián)合檢測合并HIV感染的結(jié)核病患者其敏感性超過85%。Bahk等基因重組表達Rv3369和Rv3874兩個基因，并用它們做抗原檢測結(jié)核病患者的敏感性分別為60%、74%, 特異性分別為96%、97%，表明是有價值的結(jié)核病血清學(xué)診斷抗原。其它抗原，如MPT64、P

18、90、TB4等，也曾被做為快速血清學(xué)檢測的侯選抗原加以研究，但大都未達到診斷靈敏度的要求。,摘自：陽幼榮等《結(jié)核分枝桿菌12 種抗原在結(jié)核病血清學(xué)診斷中應(yīng)用價值的研究》,結(jié)核分枝桿菌12 種抗原在結(jié)核病血清學(xué)診斷中應(yīng)用價值的研究,,,,,,血清學(xué)診斷的關(guān)鍵是尋找靈敏度高、特異性強的理想抗原。但這方面的應(yīng)用似乎并不理想。對于結(jié)核病的血清學(xué)診斷技術(shù)的研發(fā)，到現(xiàn)在已經(jīng)有100多年的歷史，但至今還沒有一種血清學(xué)診斷方法可以替代結(jié)核病痰涂片鏡檢。

19、WHO對來自不同國家的19種試劑盒產(chǎn)品進行評估，結(jié)果表明：與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒檢測的靈敏度為1%~60%，特異度為53~99% 1 。原因：由于所用的測定方法、使用的試劑種類或抗原、抗體的不同等，導(dǎo)致測定結(jié)果差異較大，并且缺乏可比性。WHO認為現(xiàn)有的血清學(xué)診斷試劑的敏感度和特異度都有待進一步提高，不推薦其作為一種快速診斷的方法在臨床使用。1WHO World Health Organization. Diagnosis ev

20、aluation series No.2: laboratory-based evalution of 19 commercially available rapid diagnostic tests for tuberculosis.2008.,血清學(xué)檢測,結(jié)核抗體測定存在的問題,1. 假陽性：3%~15%。假陽性的發(fā)生原因：1)共同抗原所致的交叉反應(yīng)；2)隱性結(jié)核菌感染包括初染、再染、非結(jié)核分支桿菌感染、卡介苗接種、結(jié)核桿菌L

21、型感染等，結(jié)果均可致結(jié)核抗體短期或較長時期的升高；3)實驗操作/試劑質(zhì)量。,2. 假陰性：30%~2%。假陰性發(fā)生的原因：1)機體方面所致的假陰性：如某些臨床確診的活動性結(jié)核患者，而體液免疫測定結(jié)果則為陰性，其原因可能與個體的免疫功能異常有關(guān)。上述原因均可導(dǎo)致機體不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量特異性結(jié)核抗體，以致于無法與正常人群的結(jié)核抗體水平相區(qū)分。2)特異性免疫復(fù)合物的形成：由于活動性結(jié)核患者體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體，可與結(jié)核抗原結(jié)合，形成免

22、疫復(fù)合物，從而導(dǎo)致結(jié)核抗體測定為陰性。3)方法方面的因素所致的假陰性：如測定方法本身靈敏度不夠、儀器不夠靈敏和影響技術(shù)條件的各種因素均可導(dǎo)致假。4)試劑質(zhì)量和操作因素：試劑靈敏度偏低是造成假陰性的主要原因之一，操作人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)也是影響因素之一。,WHO不推薦血清學(xué)檢測方法診斷活動性結(jié)核病,2011年WHO正式公告：由于目前的商業(yè)血清學(xué)試劑在結(jié)核檢測中存在較大差異，且檢測結(jié)果很高比例的假陽性和假陰性，因此不建議使用血清學(xué)方法作為結(jié)

23、核桿菌的診斷實驗1 。1WHO Commercial Serodiagnostic Tests for Diagnosis of Tuberculosis. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241502054_eng.pdf不能早期診斷！容易漏診、誤診！,,2012年4月16日，SFDA發(fā)布了《關(guān)于進一步加強結(jié)核病血液檢測試劑監(jiān)管有關(guān)事宜的通知》（食藥監(jiān)辦械【2012】

24、48號），要求各省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局按照通知要求對行政區(qū)域內(nèi)有關(guān)結(jié)核病血液檢測試劑的注冊審評情況開展檢查，試圖通過對國內(nèi)生產(chǎn)結(jié)核病診斷血清學(xué)制品的企業(yè)進行一次背景調(diào)查。分析目前國內(nèi)核病血清學(xué)檢測試劑在生產(chǎn)過程質(zhì)量控制和在臨床評價中存在的問題及解決問題的方法。,我國目前結(jié)核病血清學(xué)檢測試劑的情況,1.我國結(jié)核病血清學(xué)檢測試劑現(xiàn)狀 市場上銷售的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑有近百家，經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的

25、國產(chǎn)診斷制品抗體檢測試劑盒29個，其中經(jīng)國家級批準(zhǔn)的26個，省級批準(zhǔn)的1個，進口制品1個?？乖瓩z測試劑盒3個，其中省級批準(zhǔn)的1個。 大多數(shù)未經(jīng)批準(zhǔn)的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑游離于國家監(jiān)管范圍之外，值得引起國家有關(guān)部門及人員的關(guān)注與重視。,2. 結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)背景調(diào)查情況 調(diào)查資料的內(nèi)容主要包括試劑盒背景資料、試劑盒成品檢測、試劑盒檢測參考品制備與標(biāo)化，參考品使用情況及臨床研究等方面；通過對各生產(chǎn)企業(yè)報送

26、的資料進行分析，共收回調(diào)查問卷29份.我國目前結(jié)核病血清學(xué)診斷制品的品種與近3年的數(shù)量見下表.由于無法掌握未經(jīng)批準(zhǔn)的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑的非法銷售情況，結(jié)果并不能代表國內(nèi)實際銷售狀況。,存在的問題：,1.陽性參考品的選擇 多數(shù)企業(yè)在陽性參考品選擇時通常只選擇菌陽患者抗體強陽性血清，如果試劑某批次質(zhì)量出現(xiàn)問題，敏感度偏低時，若陽性參考品中全部使用強陽性血清，所有陽性參考品反應(yīng)均呈陽性，則無法反映該試劑的真實敏感度。如標(biāo)準(zhǔn)品中有弱

27、陽性血清的反應(yīng)可能呈陰性，提示試劑敏感度可能存在問題。因此，血清學(xué)抗體檢測試劑在質(zhì)量控制中需要強、中、弱三種不同效價的血清用于敏感度的質(zhì)量控制。同理，在試劑制備過程出現(xiàn)問題，可能產(chǎn)生假陽性時。如果陰性參考血清都選擇本底極低的樣品，可能無法檢出，因此陰性參考品應(yīng)含有臨界陰性參考血清。,,2.參考品的標(biāo)化為獲得陽性與陰性不同效價的血清，獲得血清后應(yīng)先進行初篩，再用不同的方法學(xué)對血清進行效價標(biāo)定，確定血清的效價，從中選擇不同反應(yīng)強度的樣本，

28、作為陽性或陰性參考品。但多數(shù)企業(yè)未進行細致的效價標(biāo)化，通常以試劑盒篩選后就作為檢測參考品。標(biāo)準(zhǔn)品的建立應(yīng)有規(guī)范的操作細則，至少樣品采集、檢測與標(biāo)化的過程中所有的實驗操作均需先制定SOP，再 嚴(yán) 格 遵 循SOP進行操作，并有對應(yīng)的原始記錄。從已收到的資料來看，多數(shù)企業(yè)存在不足之處。,,3.參考品的制備結(jié)核病體外診斷試劑參考品通常由陽性參考品、陰性參考品、最低檢出量或最低檢出限參考品和精密性或重復(fù)性參考品組成，用來控制試劑盒的敏感度、

29、特異度、檢出限和精密度等。但部分試劑廠家僅有陽性與陰性檢測參考品。由于參考品用于體外診斷試劑質(zhì)量控制，所以參考物質(zhì)原料的選擇取決于診斷試劑的預(yù)期用途。原料應(yīng)與試劑盒的使用要求相一致或盡可能接近，這樣可以消除方法基體效應(yīng)引入的系統(tǒng)誤差，陽性參考品應(yīng)包括痰菌陰性和痰菌陽性患者的血清，但個別企業(yè)僅采用采血站篩選的抗體陽性血清作為陽性參考品。,,4.參考品的穩(wěn)定性參考物質(zhì)的均一性和穩(wěn)定性：均一性可保證一批原料所制備的參考品均勻一致，即在不

30、同空間檢測結(jié)果的一致性和可比性；穩(wěn)定性可使一批參考品長期分發(fā)使用，為企業(yè)或科研院所提供用于質(zhì)量評價的參考品，保證在不同時間檢測結(jié)果的一致性和可比性。穩(wěn)定性考察一般需要觀察在不同溫度下放置不同時間，或經(jīng)過反復(fù)凍融后，觀察效價降低的情況。通過測定不同溫度，不同凍融次數(shù)時特征活性的降低速率，從而確定貯存的適宜溫度和時間，或反復(fù)凍融的次數(shù)。,臨床檢驗中發(fā)現(xiàn)的問題：,1.敏感度與特異度虛高WHO評估結(jié)果顯示，市售不同廠家的血液（血清學(xué)診斷）試

31、劑的敏感度和特異度變化很大，敏感度變化范圍為0~100%，特異度變化范圍為31~100%。根據(jù)收集的各企業(yè)臨床資料顯示，我國血液診斷試劑的敏感度平均值為80%左右，高于70%的占79%；特異度平均值為92%，高于90%的占95%。2. 臨床評價僅采用與同類制品進行比較評價的缺陷 部分企 業(yè) 根 據(jù) 《體 外 診 斷 試 劑 臨 床 研 究 技 術(shù) 指 導(dǎo) 原則》，“已有同品種批準(zhǔn)上市”品的臨床研究可采用已批

32、準(zhǔn)上市’質(zhì)量較好的產(chǎn)品作為對比試劑，進行對比試驗研究。3.臨床研究的規(guī)范性 多數(shù)未規(guī)范進行臨床研究，不能隨機入選客觀評價，數(shù)據(jù)經(jīng)處理修改痕跡明顯，這是導(dǎo)致臨床研究的特異度與敏感度不真實的主要因素。,32/45,近期結(jié)核病診斷方法的相關(guān)研究,,JID 2012:205 (Suppl 2), S147.,,,結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細胞，效應(yīng)T淋巴細胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-γ

33、）。因此，檢測效應(yīng)T淋巴細胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中。目前應(yīng)用的進口IGRA主要有兩種商品化的試劑：1）澳大利亞Cellestis公司的 Quanti FERON-TB GOLD In Tub

34、e（QFT-GIT）2）英國Oxford Immunotec公司的T-SPOT.TB,蛋白水平分子診斷:γ-干擾素釋放實驗（IGRA),,γ-干擾素釋放實驗（IGRA）,,γ 干擾素檢測陰性,γ干擾素檢測陽性,T-SPOT®.TB原理,T-SPOT®.TB是以擁有專利的特異抗原（ESAT-6/CFP-10），通過酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）檢測受試者體內(nèi)是否存在結(jié)核效應(yīng)T淋巴細胞，從而判斷目前該受試者是否

35、感染結(jié)核桿菌（現(xiàn)癥感染）的新方法。結(jié)核桿菌特異抗原：早期分泌抗原靶6（Early Secreted Antigenic Rarget 6，ESAT-6）培養(yǎng)濾液蛋白10（Culture Filtrate Protein 10，CFP 10）,,結(jié)核桿菌特異抗原,,由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū),ESAT-6與CFP-10抗原,結(jié)核桿菌特

36、異抗原,,蘇氏,海,堪薩斯,戈登,牛,非洲,酶聯(lián)免疫斑點技術(shù),,結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況，靈敏度高。,準(zhǔn)確—T-SPOT®.TB臨床性能指標(biāo),特異性只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng) 美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306) 國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94

37、.1%(478/508) 靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率 美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183) 國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655),,靈 敏 度,,特 異 性,,可信— T-SPOT®.TB國外指南,T-SPOT®.TB是采用γ-干擾素釋放試驗（IGRA）原理，獲得美國FDA認證、歐盟CE認證和

38、中國SFDA認證的唯一商業(yè)化產(chǎn)品列入美國、英國等歐美25個國家結(jié)核診療指南 2011年英國NICE指南、2010年美國最新結(jié)核診療指南、2010年加拿大結(jié)核指南美國CDC推薦—卡介苗（BCG）接種人群結(jié)核感染檢測首選,,各國對潛伏感染風(fēng)險人群的篩查指南,,快速—T-SPOT®.TB的實驗步驟,,用BD CPT 管或Ficoll提取液收集外周血單個核細胞,結(jié)核特異抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激結(jié)核特異的效應(yīng)T淋巴

39、細胞使其分泌γ-干擾素,效應(yīng)T淋巴細胞分泌的γ-干擾素與膜板預(yù)包被的抗γ-干擾素抗體結(jié)合并固定在細胞周圍,1個斑點=1個效應(yīng)T細胞,加入顯色液，觀察結(jié)果,過夜孵育，洗板，加入酶標(biāo)二抗,,快速—實驗效果圖,,方法學(xué)的優(yōu)點,檢測特異性的提高幫助臨床區(qū)分卡介苗接種和環(huán)境分枝桿菌感染引起的“假陽性”，避免了臨床的無效用藥檢測靈敏度的提高有利于臨床對結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治療，避免了疾病的傳播與擴散快速48小時出結(jié)果,,方法學(xué)的局限,不能區(qū)

40、分活動性TB與潛伏感染不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結(jié)合臨床的判斷目前還不能夠根據(jù)斑點數(shù)量的多少來判斷患者是活動性結(jié)核病或是潛伏感染者檢測收費高（800元/次）,,實驗結(jié)果解釋,陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細胞。假陰性結(jié)果：①感染階段不同；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/疾病；③實驗非正常操作。 陽性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥

41、狀和其它檢測指標(biāo)綜合判斷。假陽性結(jié)果：① 4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）,,假陰性/假陽性結(jié)果的原因分析,,假陰性結(jié)果分析：方法學(xué)局限性受試者因素：免疫力實驗：人員、設(shè)備問題假陽性結(jié)果分析：判斷標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境分枝桿菌感染實驗污染,武漢海吉力公司開發(fā)的結(jié)核桿菌特異性細胞免疫反應(yīng)檢測試劑盒是準(zhǔn)確、快速診斷結(jié)核感染的新結(jié)核診斷

42、方法和技術(shù),HGN-IGRA.TB,二項專利授權(quán)1、一種診斷結(jié)核病的檢測試劑盒授權(quán)公告號 CN 102175875 B2、全血INF-γ的特異性抗原蛋白、其制備方法及用途授權(quán)公告號 CN 102174114 B,第一天：體外全血刺激,第二天：ELISA定量檢測IFN-γ含量,HGN-IGRA.TB操作流程概況,,1.現(xiàn)有的血清學(xué)診斷試劑的廠家良莠不齊，試劑的敏感度和特異度都有待進一步提高，不推薦其作為一種快速診斷的方法在臨