結核特異性抗體結合肽的篩選及其在結核病血清學檢測中的應用研究.pdf

1、目的：利用純化的結核病人血清IgG從噬菌體展示隨機7肽庫中篩選結核特異性抗體結合肽，為下一步開發(fā)新的結核病血清學檢測方法提供思路。
　　 方法：篩選策略一以12份結核病人混合純化后的血清IgG作為固相配基，按吸附、洗脫、擴增的生物淘洗(簡稱淘選)過程對噬菌體展示隨機7肽庫進行篩選，并于第2至3輪的篩選中加入12份健康人血清混合純化后的IgG進行反篩，經過3輪淘選使噬菌體得到富集，從滴度測定平板上各個方位挑取結核病人IgG和健康人

2、IgG單噬菌體各20個進行擴增純化，提取單鏈DNA進行測序，間接ELISA法檢測不同單噬菌體與結核病人和健康人IgG的結合情況，鑒定出陽性克隆。篩選策略二四輪均先以上述健康人血清IgG進行反篩，再以上述結核病人血清IgG篩選，鑒定出陽性克隆。取收集的47份結核病人和37份有卡介苗接種史的健康人血清標本，采用phage-ELISA法對獲得的陽性單噬菌體進行初步驗證，并統(tǒng)計其中24份篩選用血清標本的檢測結果。陽性多肽體外合成后，建立間接EL

3、ISA檢測方法，完成147份結核病人血清、對照血清(含22份非結核病人血清和135份健康人血清)的檢測。
　　 結果：通過淘選，能與靶分子特異性結合的噬菌體得到明顯富集。單噬菌體測序分析共獲得20種共同序列。間接ELISA檢測，結果表明單噬菌體H(12)、T6、T15和T18均與結核病人IgG具有較高的親和力(S/N≥2.1)，確定為陽性克隆。其對47份結核病人和37份健康人血清標本檢出值的差異具有統(tǒng)計學意義，對其中篩選用12份

4、結核病人和12份健康人血清標本的檢出值同樣具有統(tǒng)計學差異。抗體結合肽H(12)、T15和T18，分別建立間接ELISA檢測方法，對147份結核病人血清、157份對照血清的檢測敏感性分別為59.9％，45.6％，59.2％；特異性分別為95.5％、96.2％和94.9％。
　　 結論：利用噬菌體展示隨機肽庫淘選獲得了結核特異性抗體結合肽，顯示出與結核病人IgG較特異的結合活性，為以多肽為基礎探索新的結核病血清學診斷方法提供了依據。