現(xiàn)代造血理論

1、第一篇 造血細胞及其檢驗 第一章 現(xiàn)代造血理論,造血（hematopoiesis）是指血細胞的生成過程。造血干細胞在造血微環(huán)境中增殖、分化為各類血細胞。造血系統(tǒng)通過造血器官、造血干細胞、造血調(diào)控因子等組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)來維持血液細胞的動態(tài)平衡。,第一節(jié) 造血器官和造血微環(huán)境,一、造血器官人體的造血器官是生成血液的器官起源于中胚葉，主要包括骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、 肝臟和脾等其造血過程分為胚胎期造血和出生后造血,（一）胚胎期造血

2、器官,人類的血液細胞首先在卵黃囊中形成，肝、脾、胸腺和骨髓均參與造血根據(jù)發(fā)育過程中造血中心的轉(zhuǎn)移，胚胎期造血又分為三個時期： 卵黃囊造血期 、肝造血期 、骨髓造血期,1．卵黃囊造血期（中胚葉造血期）始于胚胎3周左右，卵黃囊壁上的中胚層細胞開始分化聚集成團，稱為血島（blood island）。血島是人類最初的造血中心。血島外周的細胞逐漸變長，分化為血管內(nèi)皮細胞,血島中央的細胞形成多能造血干細胞，繼爾分化成幼稚紅細胞，以

3、后大量的多能造血干細胞遷移至肝、脾、骨髓和淋巴組織繼續(xù)增殖、分化為干細胞。胚胎 2個月后，卵黃囊逐漸退化、萎縮,被肝、脾取代其造血功能。,2．肝造血期 始于胚胎第6周，是卵黃囊血島的造血干細胞移植到肝臟的結(jié)果，以造紅細胞為主，后期可生成粒細胞和巨核細胞。肝臟是胚胎2~5個月的造血中心，持續(xù)至第7個月時，逐漸被骨髓造血替代。此外脾、胸腺、淋巴結(jié)等也參與造血。,胎肝造血的規(guī)律：造血細胞分布在肝竇、肝細胞索之間。胎肝造血以幼稚紅

4、細胞為主，巨核細胞常與紅系細胞在一起。胎肝造血細胞的密度隨妊娠日期的不同而變化。證明肝造血在第15周以前為上升期，15~30周為旺盛期，24周以后為減退時期，至出生前停止。故肝造血為第二代造血。,脾造血 始于胚胎第3個月，主要生成紅細胞、粒細胞，第5個月時產(chǎn)生淋巴細胞、單核細胞，而紅細胞和粒細胞的產(chǎn)生逐漸減少。至出生時，脾已成為產(chǎn)生淋巴細胞的器官。胸腺 在胚胎期主要產(chǎn)生淋巴細胞和少量紅細胞、粒細胞，胚胎后期成為誘導和分化T

5、淋巴細胞的器官。淋巴結(jié) 在胚胎早期可產(chǎn)生紅細胞，但時間很短，在胚胎4個月以后，成為終生制造淋巴細胞和漿細胞的器官。,3．骨髓造血期 自胚胎第14周骨髓開始造血，5個月以后成為胚胎期的造血中心。骨髓中的造血干細胞來源于肝、脾的種植，可維持終生。胚胎期的骨髓主要生成紅細胞、粒細胞和巨核細胞，也生成淋巴細胞和單核細胞。,胚胎期造血的三個時期是不能截然分開，而是此消彼長，互為交錯。,（二）出生后造血,出生后造血主要靠骨髓。在正常情

6、況下骨髓是唯一能產(chǎn)生紅細胞、粒細胞和血小板的場所，也生成淋巴細胞和單核細胞。脾和淋巴結(jié)為終生制造淋巴細胞的器官。,1．骨髓 骨髓是位于骨髓腔內(nèi)的海綿樣膠狀組織，有紅骨髓和黃骨髓之分。嬰幼兒的骨髓幾乎都參與造血，即全為紅骨髓。大約從5歲開始，長骨的髓腔內(nèi)出現(xiàn)脂肪細胞，隨年齡增長，長骨遠端的紅骨髓逐漸被脂肪組織代替轉(zhuǎn)化為黃骨髓。,到18歲以后，紅骨髓只限于顱骨、脊椎骨、肋骨、胸骨、骼骨以及長骨的近心端。因此，在作骨髓穿刺或活檢

7、時，成人可選擇的部位是骼骨、棘突、胸骨等處，脛骨粗隆則只適用于2歲以下的幼兒。成人的紅骨髓和黃骨髓約各占50%，但黃骨髓仍有造血潛能，當機體需要時又轉(zhuǎn)變?yōu)榧t骨髓而參與造血。,2.淋巴器官 分為中樞淋巴器官和周圍淋巴器官。中樞淋巴器官主要包括胸腺和骨髓，主導淋巴細胞的產(chǎn)生、增殖、分化和成熟。周圍淋巴器官主要包括淋巴結(jié)、脾、腸粘膜相關(guān)淋巴組織等，是淋巴細胞聚集和免疫應(yīng)答發(fā)生的場所。,(1)胸腺（thymus）來自骨髓的淋巴干細

8、胞經(jīng)增殖和在胸腺素的作用下，誘導分化為免疫活性細胞，進入胸腺髓質(zhì)，然后釋放入血并遷移到外周淋巴器官的胸腺依賴區(qū)成為胸腺依賴淋巴細胞即T細胞。青春期后，胸腺逐漸退化，被脂肪組織取代。,(2)淋巴結(jié)（lymph node）淋巴結(jié)的外周部分為皮質(zhì)，B細胞在淋巴結(jié)皮質(zhì)區(qū)濾泡中央增殖、發(fā)育；皮質(zhì)深層和濾泡間隙為副皮質(zhì)區(qū)，富含由胸腺遷移而來的T細胞，又稱胸腺依賴區(qū)；淋巴結(jié)中央部分為髓質(zhì)，髓質(zhì)區(qū)的B細胞、漿細胞及巨噬細胞集結(jié)構(gòu)成髓索,(3)脾

9、脾切面大部分呈暗紅色，稱紅髓，其中散布著許多灰白色小結(jié)節(jié)，為白髓。白髓是淋巴細胞的聚集處，在中央小動脈周圍主要是T細胞，是脾的胸腺依區(qū)；白髓中的脾小結(jié)位于脾動脈周圍淋巴鞘內(nèi)一側(cè)，內(nèi)有生發(fā)中心，主要由B細胞構(gòu)成。脾具有造血、儲血及免疫等多種功能，是T、B細胞分化成熟的主要場所之一。,3.髓外造血正常情況下，胎兒出生2個月以后，骨髓以外的組織如肝、脾淋巴結(jié)等不再制造紅細胞、粒細胞和血小板。但在某些病理情況下，如骨髓纖維化、骨髓增生

10、性疾病及某些貧血，這些組織又恢復(fù)造血功能（?？蓪е孪鄳?yīng)器官腫大），稱為髓外造血。,髓外造血是機體對血細胞的需求特別增高或?qū)撬柙煅系K的一種補償，尤其常見于兒童。這種代償作用有限且不完善。髓外造血部位除肝、脾、淋巴結(jié)外，也可以累及胸腺、腎、腎上腺、腹腔后脂肪及胃腸道。,二、造血微環(huán)境,造血微環(huán)境（hematopoietic microenvironment）是指造血細胞生長、發(fā)育的內(nèi)環(huán)境。由微血管系統(tǒng)、末梢神經(jīng)、基質(zhì)、基質(zhì)細胞及

11、基質(zhì)細胞分泌的細胞因子等組成，不僅是造血細胞的支架，還可通過細胞之間的相互作用和釋放的細胞因子影響造血活動。,（一）骨髓微血管系統(tǒng),骨髓微血管系統(tǒng)是造血微環(huán)境的重要組成部分,其功能在于向造血組織輸送營養(yǎng)物質(zhì)，排出代謝廢物，從而有利于造血細胞的更新。毛細血管注人管腔膨大的靜脈竇，再彼此溝通匯集成集合竇，最后進人中央靜脈。靜脈竇與集合竇（統(tǒng)稱為骨髓血竇）是骨髓血管系統(tǒng)的核心結(jié)構(gòu)。,血竇（Sinusoid） 是動脈毛細血管分成的不規(guī)則竇狀

12、腔隙。血竇內(nèi)是成熟的血細胞，血竇之間則充以骨髓實質(zhì)(造血索)，主要是活躍的造血實質(zhì)細胞。血竇壁是由連續(xù)的內(nèi)皮細胞、顆粒狀基底膜和外皮細胞所組成，其竇壁的薄厚是可變的,絕大多數(shù)的竇壁僅有一層內(nèi)皮細胞組成，平時無孔，當血細胞穿過內(nèi)皮細胞時形成臨時通道。,不同造血功能的骨髓其微血管的結(jié)構(gòu)不同造血功能旺盛時，骨髓血竇很豐富，竇壁孔隙增多；造血功能低下的骨髓，骨髓血竇減少，無造血功能的黃骨髓中，微血管呈毛細管狀。骨髓的微血管系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)

13、物質(zhì)與能量的交換、血細胞的釋放、組織內(nèi)的酸堿度、氧和二氧化碳分壓等影響造血細胞的增殖和分化。,（二）骨髓神經(jīng),骨髓的神經(jīng)來源于脊神經(jīng)，其神經(jīng)供應(yīng)十分廣泛，骨髓的全部動脈都伴有神經(jīng)束，其分支纏繞于動脈壁呈網(wǎng)狀，神經(jīng)纖維終止于動脈壁的平滑肌纖維。骨髓小動脈上的交感神經(jīng)纖維受延髓血管運動中樞的控制，但絕大多數(shù)的骨髓微血管床主要受血管活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)。,骨髓神經(jīng)的作用：（1）通過調(diào)節(jié)血管的舒縮，改變血竇的大小及血流速度的快慢等影響造血（2）

14、神經(jīng)分泌的體液因子可直接作用于造血細胞（3）基質(zhì)細胞分泌的細胞因子調(diào)節(jié)造血功能,（三）基質(zhì)細胞及其分泌的調(diào)控因子,骨髓基質(zhì)細胞包括成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、脂肪細胞和巨噬細胞等，它們通過與造血干細胞的密切接觸起到支持和營養(yǎng)造血細胞的作用。各種基質(zhì)細胞都有分泌細胞因子的功能，其分泌的生物大分子物質(zhì)都與造血細胞的粘附有關(guān)，可粘附固定造血細胞。,基質(zhì)細胞還分泌多種細胞因子，如白細胞介素、FLT-3配基、干細胞因子、粒一巨噬細胞集落刺激因子

15、、粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子等，這些細胞因子不僅直接作用于造血細胞，而且作用于基質(zhì)細胞，改變基質(zhì)細胞的增殖和分泌狀況，誘導其它細胞因子的生成。對造血細胞的增殖、分化和發(fā)育成熟起重要的調(diào)控作用。,Go on....,第二節(jié) 造血細胞的生長發(fā)育和造血調(diào)控,一、造血細胞的生長發(fā)育胚胎造血組織的發(fā)育是血細胞發(fā)生、發(fā)育研究的基礎(chǔ)，也是血液學研究必不可少前提。造血細胞的生長發(fā)育是一個連續(xù)不斷的復(fù)雜過程，造血器官內(nèi)的各種造血細

16、胞在造血微環(huán)境中通過細胞與細胞之間的相互作用，在各種細胞因子的誘導下，按一定的規(guī)律發(fā)育成為各種成熟的血細胞，然后釋放入血循環(huán)中。,（一）造血細胞生長發(fā)育的概念,造血細胞的生長發(fā)育包括增殖、分化、成熟和釋放四個方面。造血細胞的增殖是指血細胞通過分裂而使其數(shù)量增加的過程。有絲分裂是造血細胞的主要增殖方式。,母細胞有絲分裂后形成的子細胞同時都傾向分化成熟。子細胞還可進一步增殖，每增殖一次就越傾向于進一步分化。一般來講，一個原始細胞到成

17、熟細胞可經(jīng)過4~5次分裂，如1個原始紅細胞可產(chǎn)生32個或64個成熟紅細胞。而巨核細胞的增殖（連續(xù)雙倍增殖DNA）與其他系統(tǒng)血細胞的增殖方式不同，每增殖一次，核增大一倍，但胞質(zhì)并不分裂，屬多倍體細胞，形態(tài)上也表現(xiàn)為從原始到成熟胞體逐漸變大。,造血細胞的分化（differentiation）是指細胞發(fā)育過程中失去某些潛能又獲得新的功能的過程，即由多潛能轉(zhuǎn)變?yōu)閱螡撃艿倪^程。分裂后的細胞在形態(tài)和功能上產(chǎn)生了新的特征，分化過程是不可逆的。,

18、造血細胞的成熟（maturation）是細胞從造血干細胞定向分化后，從原始經(jīng)幼稚到成熟的細胞發(fā)育過程，血細胞越成熟其形態(tài)越易辨認，功能也日趨完善。,成熟的血細胞在骨髓內(nèi)通過“髓血屏障”釋放入血循環(huán)中，各種調(diào)節(jié)因素控制著血細胞的增殖、分化、成熟和釋放，從而維持血細胞數(shù)量和質(zhì)量的穩(wěn)定。,（二）造血細胞生長發(fā)育的過程,根據(jù)造血細胞的功能和形態(tài)特征，造血細胞的生長發(fā)育過程可為：造血干細胞、造血祖細胞、原始及幼稚細胞三個階段。原始及幼稚

19、細胞階段的細胞是在骨髓涂片中從形態(tài)學上可以辨認各系各階段的血細胞。,,,,,造血干細胞階段,造血組細胞階段,原始及幼稚細胞階段,成熟細胞,二、造血干／祖細胞,干細胞（stem cell）是具有自我復(fù)制和多向分化能力的細胞。早期胚胎中的原始生殖細胞即胚胎干細胞，具有廣泛的發(fā)育和分化潛能，稱為全能干細胞（totipotent hematopoietic stem cell,T HSC）。胚胎干細胞可分化為各類組織干細胞，造血組織中存在造

20、血干細胞、血管干細胞和間質(zhì)干細胞。,（一）造血干細胞,造血干細胞（hematopoietic stem cell, HSC）的概念于20世紀初就有人提出，但當時的含義不甚明確，研究內(nèi)容模糊不清，直至發(fā)現(xiàn)了脾集落形成單位之后，造血干細胞在六七十年代引起了人們的關(guān)注。隨著新技術(shù)的發(fā)展，造血干細胞在臨床應(yīng)用等方面潛在的巨大價值被逐步發(fā)現(xiàn)，目前已成為生命科學研究領(lǐng)域的熱門課題。,造血干細胞又稱多能干細胞，由中胚層細胞分化而來，是各種血細胞的始

21、祖，具有高度自我更新、多向分化和增殖能力，并且在造血組織中含量極少，其形態(tài)酷似小淋巴樣細胞而難以辨認。在體內(nèi)造血干細胞多數(shù)處于G0期。造血干細胞可增殖分化為髓系干細胞和淋巴干細胞。,1.造血干細胞的基本特征(1)自我更新：即細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的兩個子代細胞與親代細胞具有相同的特征。造血干細胞的自我更新是維持其數(shù)量平衡的基礎(chǔ)，亦稱自我維持。高度的自我更新能力是造血干細胞基本的生物學特征之一。,(2）多向分化：即造血干細胞具備分化為

22、各系造血祖細胞的潛能，是造血干細胞的另一個基本的生物學特征，造血干細胞的分化受到多種正負調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，在特定的條件下可以分化成紅細胞、粒細胞（中性、嗜酸性、嗜堿性）、單核細胞、血小板、組織嗜堿細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞及自然殺傷細胞等的祖細胞。分化是不可逆的，造血干細胞一旦定向分化為某種祖細胞，就不可能再變成其他的祖細胞。,2．造血干細胞檢測 單個細胞在生物體內(nèi)有能力長期重建造血是判斷該細胞為造血干細胞的“金標準”。由于造

23、血干細胞的數(shù)量極少，且形態(tài)上不能區(qū)別，也沒有造血干細胞的表面標志，目前還沒有建立體外直接測定造血干細胞的方法。,（1）脾集落測試法 1961年Till等首先采用體內(nèi)試驗小鼠脾集落形成間接證明了造血干細胞的存在：將受體小鼠以致死劑量射線照射后，破壞全部造血細胞，動物因造血功能衰竭而死亡；如輸以供體骨髓或血液，小鼠能存活，并在受體小鼠脾中形成紅系、粒系、巨核系細胞組成的結(jié)節(jié)即脾集落，經(jīng)證實所有這些細胞都是由單個細胞增殖分化而來，即脾集

24、落形成單位（CFU-S）；如將脾結(jié)節(jié)細胞靜脈注射給受體小鼠，該小鼠也能存活。證實了骨髓或血液中存在血液細胞的祖先細胞。,20世紀80年代出現(xiàn)了一系列體外檢測造血干細胞的試驗方法，但只能部分證實造血干細胞自我更新和多向分化兩個特征，如混合集落(CFU-Mix )培養(yǎng)， 高增殖潛能細胞(HPP-CFC）培養(yǎng)， 原始細胞集落形成細胞（CFU-Blast )培養(yǎng)，長期培養(yǎng)起始細胞（LTC-IC )檢測等。,（2）單克隆抗體法 利用F

25、ACS自動細胞分選系統(tǒng)分選出單個CD34+細胞亞群細胞----CD34+CD38+及CD34+CD38—，在無血清體系中加入各種細胞因子（如SCF、IL-3、IL-6、GM-CSF及Epo）刺激，結(jié)果表明，CD34+ CD38—單個細胞可形成原代集落，并可向紅系、粒系、巨噬系、巨核系等 細胞分化。證明了CD34+CD38—細胞的性能接近于造血干細胞，同時也證明了造血干細胞具有多向分化的能力，還有實驗表明，造血干細胞具有向淋巴細胞分化的

26、能力。,目前造血干細胞的表面標記尚未確定。一般認為CD34陽性細胞具有長期重建造血的能力，推測部分造血干細胞CD34陽性；CD34陽性CD38陰性細胞比CD34陽性細胞具有更強的長期造血能力；AC 133陽性細胞也被認為是早期造血細胞的標志。明確造血干細胞的表面標記不但具有重要理論價值，也有助于分離純化高質(zhì)量的造血干細胞供臨床應(yīng)用。,（二）造血祖細胞,造血干細胞進一步分化為各種造血祖細胞（hematopoietic proge

27、nitor cell）。造血祖細胞是一類由造血干細胞分化而來，但失去自我更新能力的過渡性、增殖性的細胞群，過去稱為定向干細胞。,造血祖細胞有年齡結(jié)構(gòu)，根據(jù)其分化能力，可分為多向祖細胞和單向祖細胞，多向祖細胞可進一步分化 為單向祖細胞。通過體外造血細胞半固體培養(yǎng)證實了造血祖細胞的存在。,產(chǎn)生紅細胞的祖細胞稱為： 紅細胞爆式集落形成單位（BFU-E)（早期） 和紅細胞集落形成單位(CFU-E),BFU-E,產(chǎn)生粒細胞和單核

28、細胞的祖細胞稱為： 粒-單核細胞集落形成單位（CFU-GM）,CFU-GM,產(chǎn)生巨核細胞的祖細胞稱： 巨核細胞集落形成單位（CFU-Meg）,CFU-Meg,另外，產(chǎn)生嗜酸性粒細胞的祖細胞稱為嗜酸性粒細胞集落形成單位（CFU-Eo）；產(chǎn)生嗜堿性粒細胞的祖細胞稱為嗜堿性粒細胞集落形成單位（CFU-Bas）；產(chǎn)生T淋巴細胞的祖細胞稱為T淋巴細胞集落形成單位（CFU-TL）；產(chǎn)生B淋巴細胞的祖細胞稱為B淋巴細胞集落形成

29、單位(CFU-BL) 。這些祖細胞失去了自我更新的能力，但有較強的增殖和定向分化能力。造血祖細胞表面的主要免疫標記已明確，因此，根據(jù)這一特性，可采用流式細胞術(shù)或其他免疫學技術(shù)來分析造血祖細胞，甚至可以使之分離純化。,（三）造血干／祖細胞的臨床應(yīng)用,造血干／祖細胞的臨床應(yīng)用主要涉及到造血干／祖細胞移植。目前造血干／祖細胞主要來源于骨髓、外周血和臍血，不同來源的造血干／祖細胞的移植在臨床上各有其優(yōu)缺點。,造血干／祖細胞移植主要應(yīng)用于：

30、1.血液系統(tǒng)惡性腫瘤，如急、慢性白血病等；2.血液系統(tǒng)非惡性腫瘤性疾病，如再生障礙性貧血、異常血紅蛋白病、Fanconi貧血、難治性貧血等；3.實體腫瘤化療后造血重建，如乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤等；4.其他，如重癥聯(lián)合免疫缺陷癥、自身免疫性疾病、基因治療等。,三、造血調(diào)控,造血細胞的增殖、分化受控于不同的調(diào)控系統(tǒng)，以保持各種血細胞數(shù)量和質(zhì)量的相對穩(wěn)定。造血調(diào)控作用于血細胞發(fā)育的每一階段，體內(nèi)許多因素參與了這一過程，其中細胞

31、因子的調(diào)控占重要地位。細胞因子（cytokines）是一組基因編碼的低分子量蛋白質(zhì)細胞外信號分子，有的是糖蛋白，有的則不含糖基，在機體內(nèi)含量極低，半衰期短，主要功能是在細胞間傳遞信息，從而影響造血活動。,（一）集落刺激因子類( colony-stimulating factors, CSFs )CSFs在半固體細胞培養(yǎng)中能促進造血細胞集落形成。主要有以下幾種：1.紅細胞生成素（erythropoietin，EPO） 主要的

32、生物學功能是刺激紅系祖細胞的增殖和分化，以提高紅細胞數(shù)量。2.粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 除促進粒系祖細胞形成集落外，G-CSF可誘導某些白血病細胞株分化成熟，激活中性粒細胞的吞噬功能，誘導早期造血干／祖細胞從場期進人細胞周期。,3.粒一巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF) GM-CSF除了促進中性粒細胞、單核細胞祖細胞增殖、分化成熟外，對成熟細胞也產(chǎn)生作用4.巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF） 促進單核系

33、祖細胞的增殖和分化，激活巨噬細胞的吞噬和分泌功能。5.多系集落刺激因子（multi-CSF） 促進造血干／祖細胞的增殖、分化，促進多系集落生長。6.血小板生成素（thrombopoietin, TPO）促進造血干／祖細胞的增殖、分化；促進巨核細胞集落形成。,（二）白細胞介素（interleukin, IL)白細胞介素主要是白細胞產(chǎn)生的信號分子，不僅在免疫系統(tǒng)中傳遞信息，同時也參與造血系統(tǒng)的造血調(diào)控，其主要生物學功能見（臨床免

34、疫學檢驗》。,（三）其他細胞因子1.干細胞因子（stem cell factor, SCF） 又稱肥大細胞生長因子 促進肥大細胞生長；協(xié)同促進造血干／祖細胞增殖、分化。2．FLT-3配基(FLT-3 ligand, FL) 誘導處于靜止期的造血干／祖細胞進人細胞周期，促進其擴增。,目前發(fā)現(xiàn)對造血有調(diào)節(jié)作用的細胞因子有近50種，它們對造血的調(diào)控有正向和負向調(diào)節(jié)，一種細胞因子對一類細胞可能以正向調(diào)節(jié)為主，而對另一類細胞則可能是

35、反向抑制，并且不同的濃度作用效果也不一樣。大多數(shù)人類的細胞因子可以通過基因工程制備，有的已成功用于臨床，如EPO較早地用來治療各種貧血，尤其是與腎功能衰竭、化療、腫瘤骨髓浸潤有關(guān)的貧血，取得了顯著療效；G-CSF應(yīng)用于治療化療引起的中性粒細胞減少癥，骨髓移植和外周血造血干／祖細胞的動員等。,第三節(jié) 造血干／祖細胞體外培養(yǎng)技術(shù),體內(nèi)造血干／祖細胞在一個極復(fù)雜的造血微環(huán)境中增殖、分化生成血液細胞。體外造血祖細胞培養(yǎng)就是在體外模擬體內(nèi)的

36、生理環(huán)境，將從機體中分離出的造血祖細胞進行培養(yǎng)，使之生存、增殖分化。,造血祖細胞培養(yǎng)主要應(yīng)用于：1）檢測造血祖細胞在骨髓、外周血和臍血中的數(shù)量2）研究體外造血祖細胞類型、特性及生理意義3）利用人工培養(yǎng)條件易于改變并能嚴格控制的特點，研究造血調(diào)節(jié)；4）用于造血系統(tǒng)疾病發(fā)生機制，診斷、預(yù)后判斷、療效觀察及治療藥物的選擇等方面的研究。,一、造血干／祖細胞體外培養(yǎng)的基本條件,（一）實驗室條件（二）培養(yǎng)的支持物（三）營養(yǎng)液（四）細胞

37、因子（五）血清,二、造血干／祖細胞體外培養(yǎng),各種造血祖細胞的培養(yǎng)條件、體系組成雖有差異，但培養(yǎng)過程大致相同。 造血祖細胞的培養(yǎng)步驟如下：（1）分離培養(yǎng)細胞，并制成單個核細胞懸液。（2）配制培養(yǎng)體系：按比例將培養(yǎng)液、細胞、血清、刺激因子加入培養(yǎng)體系瓶內(nèi)，混勻。（3）將配制的培養(yǎng)體系在37℃水浴，保溫10min。,（4）培養(yǎng)體系保溫的同時，將瓊脂等支持物煮沸融化（甲基纖維素不需加熱）。（5）待支持物降至40℃左右，加入培養(yǎng)體

38、系并混勻。（6）將混勻后的培養(yǎng)體系加入培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板孔內(nèi)，一般平行做3份。（7）待培養(yǎng)物冷卻凝固后，于5%CO2、飽和濕度及37℃溫箱內(nèi)孵育。CFU-GM需7~10天，CFU-E需7天，BFU-E需14天。（8）觀察結(jié)果。包括記數(shù)集落數(shù)，對部分難以確定細胞性質(zhì)的集落應(yīng)固定、染色后分析。,（一）粒一單核細胞系祖細胞（CFU-GM）培養(yǎng)【原理】受檢者血液或骨髓經(jīng)過分離獲得的單個核細胞在適當?shù)募毎蜃?GM-CSF)作用下，在體外半固

39、體瓊脂上形成由不同成熟階段的粒細胞和單核細胞組成的細胞集落。每個集落可視為由一個粒一單核細胞系祖細胞增殖、分化而來。集落數(shù)的多少可以反映造血細胞中粒一單核細胞系祖細胞的水平。,（二）紅系祖細胞（BFU-E,CFU-E）培養(yǎng)【原理】在培養(yǎng)體系中加人適量的EPO，使骨髓中的造血細胞在半固體培養(yǎng)基上形成由紅細胞組成的集落（BFU-E和CFU-E）。每個集落可視為一個紅系祖細胞增殖分化而來，集落的多少可反映造血細胞中紅系祖細胞的量。,Than