組織切片技術(shù)

1、組織切片技術(shù)組織切片技術(shù)姓名：許莎班級：生技121學號：12772018組織切片技術(shù)是研究生物組織或細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)，對于促進細胞生物學和遺傳學等研究的發(fā)展起著重要作用。最早的制片技術(shù)是徒手切片技術(shù)，以后發(fā)展了利用石蠟進行包埋和切片的制片技術(shù)，即石蠟切片技術(shù)，該技術(shù)由于成本低，操作簡單，目前仍在應用，該技術(shù)被越來越多的研究工作者應用于發(fā)育學、植物細胞學、胚胎學、解剖學等研究領(lǐng)域。1組織切片技術(shù)原理組織切片技術(shù)原理1.1原理原理組

2、織切片技術(shù)是研究組織形態(tài)學最常用的一項基本技術(shù)，在制作胚胎或組織切片時，由于細胞或組織是柔軟的或局部的軟硬不均，這樣制作厚薄均勻的切片很困難。為了能清晰地觀察到組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)，必須先經(jīng)過一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬然后利用切片機將組織切成薄片。根據(jù)所用支持劑的種類不同，主要分為石蠟切片、冰凍切片、振動切片、火棉膠切片、塑料切片、碳蠟切片等。1.2分類分類1.2.1石蠟切片該技術(shù)是最重要、最常用的組織切片技術(shù)之一，起

3、始于18世紀。此法是用石蠟作為包埋劑，將材料經(jīng)過固定、脫水、透明后包埋在石蠟中，然后連同石蠟用切片機一同進行切片。石蠟切片的主要優(yōu)點是不僅可以把材料制成薄的切片，而且還能制成連續(xù)切片，這是其他制片技術(shù)難以做到的。它的缺點是操作步驟比較復雜，而且材料在脫水、透明過程中會收縮、變硬、變脆，以致不易切片[1]。1.2.2冰凍切片冰凍切片是利用干冰或液氮等速凍劑使組織迅速冷凍硬化，將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機切片的一項技術(shù)。它實際上是以水為包

4、埋劑，將組織進行冰凍至堅硬后切片的。由于此法不需要經(jīng)過各級乙醇的脫水、二甲苯的透明和浸蠟等步驟，因而較適合子脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學的制片，并作為快速切片的方法應用在臨床診斷冰凍切片是酶組織化學和免疫組織化學染色中最常用的一種切片方法。此種切片的優(yōu)點是能較好的保存組織的RNA穩(wěn)定性、較完好地保存細胞膜表面和細胞內(nèi)多種酶活性以及抗原的免疫活性，缺點是需要較高的設備要求切片較厚，導致組織結(jié)構(gòu)顯示欠佳通常不能進行連續(xù)切片。其主要操作技術(shù)和

5、方法與石蠟切片過程和類似。1.2.3振動切片是用振動切片機把新鮮的組織切成厚20100pm的切片。此類切片的優(yōu)缺點類似于冰凍切片。通常在切片后進行免疫染色然后再進行電鏡切片以此來彌補結(jié)構(gòu)顯示不清的不足。振動切片機主要用于新鮮或經(jīng)過固定的動、植物標本的制片，切片時組織標本不需冰凍或包埋。因此.樣品片既避免了冰晶破壞，又能保持其活性和細胞良好形態(tài)為免疫細胞化學研究以及脊髓和腦薄片的神經(jīng)生物學研究提供了良好條件。振動式切片機可以對不同的材料進

6、行切片，在應用范圍上補充了使用傳統(tǒng)切片機的不足，是當代電鏡、解剖、組胚、生理、醫(yī)院化工等實驗系統(tǒng)最理想的快速制樣切片儀器。1.2.4火棉膠切片黑紙上。切片操作時應注意隨時關(guān)好停刀軋，不能對著蠟帶講話以免吹散蠟帶切片完畢，將刀取下擦凈。涂上潤滑油，放人盒內(nèi)保存。9.粘片、展片：通過粘貼劑把合格蠟帶貼在載玻片上，在貼的同時，借助水的張力使蠟帶完全伸展、平貼在載玻片上，粘片和展片是在載玻片上同時完成的步驟。常用的粘貼劑有蛋白粘貼劑和明膠甘油粘

7、貼劑兩種10.脫蠟、透明：在染色之前，需要用脫蠟劑溶去組織和細胞的石蠟，進一步清洗脫掉的石蠟，使細胞、組織透明清晰，用于脫蠟和透明的試劑是二甲苯。11.染色：為了使植物組織和細胞各部分顯像清楚，必須進行染色。運用不同的染色方法和選用不同的染色劑，使組織或細胞某一部分染上顏色，另一部分不染上顏色成為背景或?qū)⒉煌糠秩境刹煌念伾?，可使組織細胞在光學顯微鏡中顯像清晰，便于觀察。12封片：切片染色后用膠類物質(zhì)將其封固，以利于長期保存。2切片技

8、術(shù)的應用切片技術(shù)的應用2.1石蠟切片技術(shù)的應用石蠟切片技術(shù)的應用石蠟切片雖然是經(jīng)典的方法但隨著新的儀器和研究技術(shù)的不斷問世，出現(xiàn)了與其他新的技術(shù)方法相結(jié)合，從而開辟了許多新領(lǐng)域[2]，增加了許多新的研究、觀察內(nèi)容，使組織學的觀察研究從簡單的形態(tài)結(jié)構(gòu)深入到各種成分的定性觀察，定量計測，使細胞組織的形態(tài)、功能及代謝三結(jié)合，從而達到定性可靠、定位準確及定量可測，最終闡述了生命活動的最基本規(guī)律。2.1.1三維重建重建技術(shù)在闡明生物體組織結(jié)構(gòu)與生

9、理功能之間的關(guān)系以及在形態(tài)學、比較解剖學、細胞化學定位等領(lǐng)域的研究中有著重要的意義。早在1958年，Sjostr就論證了這種方法的可行性和可靠性[3]，是最早報道利用組織切片進行骨二維重建的學者，隨后LUCZ也用同樣的方法進行了嘗試，但是，由于當時的切片技術(shù)和計算機技術(shù)都較落后，故效果不如人意。直到2000年Mason[4]再次用同樣的方法進行了三維重建。隨著計算機技術(shù)的不斷發(fā)展，這項技術(shù)在國際上正在繼續(xù)進行廣泛深入的研究，在國內(nèi)也引起

10、了廣泛的研究興趣，例如對血管大鼠松質(zhì)骨、中國虛擬人[5]行切片后三維重建，同時也對方法進行了很多研究。特別是目前正在研究的“中國虛擬人1號”，表明我國是繼美、韓之后世界上第三個用人體切片合成虛擬人的國家。2.1.2免疫組化組織制片技術(shù)與免疫學技術(shù)結(jié)合構(gòu)成免疫組織化學技術(shù)，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，檢測組織切片中細胞組織的多肽及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的定性和定位觀察研究。冰凍切片手續(xù)簡便，制片過程中抗原活性丟失少，但組織細胞形態(tài)較差石蠟

11、切片步驟繁多。一般石蠟包埋的組織切片用于檢測胞漿或核內(nèi)的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定劑對抗原破壞較輕，但結(jié)構(gòu)保存較差。2.1.3原位雜交隨著分子生物學的發(fā)展，在SouthernblotNthernblot等分子雜交技術(shù)基礎上建立了原位雜交技術(shù)。原位雜交技術(shù)具有高度的準確性和敏感性，它能在細胞甚至亞細胞的水平上定位特異性核酸分子序列。因而，這一技術(shù)是目前研究分子細胞生物學、發(fā)育學等方面的重要手段[6]。例如，在心肌石蠟切片中