冷凍切片技術(shù)

1、第二章 生物組織冷凍切片技術(shù),冷凍切片技術(shù),冷凍切片（frozen section）是一種在低溫條件下，將動物、植物組織快速冷卻到一定硬度，然后進行切片的方法。因其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，而應用廣泛。冷凍切片的種類較多，有低溫恒冷箱冷凍切片法，二氧化碳冷凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冷凍切片法等。,2.1 CM 1900簡介,CM 1900是徠卡奉獻給廣大用戶用于各種已知低溫冷凍切片的真正有效的儀器。 冷凍切片機用來

2、將生物組織的標本快速冷凍后，將標本在低溫狀態(tài)下進行微米級的超薄切片，為生物組織的分析研究提供快速優(yōu)良的組織切片。特點：·新型CM 1900的特色之一是具有大型冷凍室，可冷卻到-35°C。·該儀器還提供一個獨立的樣品冷卻系統(tǒng)，樣品夾溫度的調(diào)節(jié)范圍達到-10°C到-50°C，可進行不同類型的樣品切片，每一樣品托有各自獨立的溫度，并可在很短的時間內(nèi)達到所需溫度,快速冷凍臺保持在-

3、45°C，可同時放多達10個樣品，并和一個可持續(xù)冷卻的吸熱器相連，可保證樣品托上的樣品快速冷卻.高質(zhì)量，無焊接縫的不銹鋼冷凍室表面光滑，利于清潔和防止污染。,規(guī)格參數(shù)：1.        切片厚度：1至60um2.        最大樣品：55 mm直徑3. &#

4、160;      樣品臂前后移動：25 mm4.        樣品臂上下移動：59 mm5.    樣品臂前后移動速度：0.8mm/秒 冷凍箱溫度:0至-35℃6.      

5、60; 冷凍箱降溫至:-35℃約4小時7.        除霜功能:以熱氣9分鐘除霜,可自由于24小時內(nèi)設(shè)置開始時間8. 可隨時按制即時除霜. 快速冷凍臺:至-45℃9.        機身大小(長/深/高):890/730/1200mm10.   

6、 機身重量(連機切片):180kg11.     獨特雙壓縮作樣品快速冷凍及穩(wěn)定冷凍切片溫度12.     樣品快速冷凍:-10℃至-50℃,2.2 操作,,2.3 維護,2.4 故障排除,2.5. 冷凍切片的一點體會,取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為正方或長方體：1×1×0.5cm ；

7、0.5 ×0.5×0.5cm 。 取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細小組織，滴上包埋劑。 將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平。調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。,調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防

8、卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細心，準確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當?shù)奈恢谩Ｇ衅瑫r，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。 應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調(diào)在-15～

9、20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調(diào)至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調(diào)至-30℃。,2.6 冰凍切片時的注意事項：,防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺上凍起來，然后依據(jù)不同

10、的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。,放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂“砍柴看柴勢”，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。 組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現(xiàn)冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經(jīng)固定前，其中的水份也可滲入到組

11、織中去，當冰凍發(fā)生時，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。,當切片時，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點。用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當它們碰撞在一

12、起時，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。,2.7 HE染色介紹,蘇木精 — 伊紅染色法 ( hematoxylin-eosin staining ) ，簡稱HE染色法 ，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。蘇木精染液為堿性 ，主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍色 ；伊紅為酸性染料 ，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色 。HE

13、染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。,染色結(jié)果 細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍色，粘液呈灰藍色。細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。 著色情況與組織或細胞的種類有關(guān)，也隨其生活周期及病理變化而改變。例如，很多細胞在新生時期胞漿對伊紅著色較淡或輕度嗜

14、堿，當其衰老時或發(fā)生退行性變則呈現(xiàn)嗜伊紅濃染。膠原纖維在老化和出現(xiàn)透明變性時，伊紅著色由淺變深。,2.7.1 試劑配置,0.5~1% 的伊紅酒精溶液： 稱取伊紅Y 0.5~1 g，加少量蒸餾水溶解后，再滴加冰醋酸直至漿糊狀。以濾紙過濾，將濾渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工業(yè)酒精，如果不怕浪費，用無水乙醇配制也可）100毫升溶解。,蘇木素染液配方：(配制3000 ml，可按比列減少),蘇木精 6 g 　　無水乙醇 100

15、ml 　　硫酸鋁鉀 150 g 　　蒸餾水 2000 ml 　　碘酸鈉 1.2 g 　　冰醋酸 120 ml 　　甘油 900 ml 　配制方法：將蘇木素溶于無水乙醇，再將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水，溶解后將甘油傾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸鈉。,1%鹽酸酒精分化液：將1毫升濃鹽酸加入99毫升70%酒精中即可。促藍液：1% 濃氨水溶液（1：99）,2.7.2 改進的冷凍切片HE染色步驟,固定　切好的切片用95 %乙醇95 m