tunel-roche使用流程

1、InsitucelldeathdetectionkitPOD法一、原理：TUNEL（TdTmediateddUTPnickendlabeling）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）把熒光素（fluescein）標(biāo)記的dUTP（三磷酸脫氧尿甘）連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，hseradishperoxi

2、dase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，HRP又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。二、

3、器材與試劑器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含TdT10、熒光素標(biāo)記的dUTP1、標(biāo)記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5μl20DAB1μL30%H2O294μlPBS）、ProteinaseK工作液（1020μgmlin10mMTrisHCl，pH

4、7.48）或細(xì)胞通透液（0.1%TritonX100in0.1%sodiumcitrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase1（3000Uml–3Umlin50mMTrisHCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mgmlBSA）等。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)處理：①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見備注4），干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4℃保存；②適當(dāng)方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組，各組離心收集約1106個(gè)細(xì)胞，PBS洗一

5、次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然干燥，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上；③將吸附細(xì)胞的載玻片在4%多聚甲醛（見備注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤將吸附細(xì)胞的載玻片在0.2%的TritonX100（見備注5）中處理5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的6—15四、注意事項(xiàng)1.進(jìn)行PBS清洗時(shí)，每次清洗5min。2.PBS清洗后，為了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS溶液后再進(jìn)

6、行下一步反應(yīng)。3.在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。4.TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的失活。5.如果20DAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。6.用甲基綠（MethylGreen）染液（35%甲基綠溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0）染色后，請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的

7、甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過光學(xué)顯微鏡觀察操作。如果此時(shí)使用80~90%的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。7.熒光素標(biāo)記的dUTP液含甲次酸鹽和二氯鈷等致癌物，可通過吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，注意防護(hù)。8.試劑保存；未打開的試劑盒貯存在20℃（15~25℃）；converterPOD液一旦解凍，以后就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6m內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反應(yīng)液臨