植物成分分析

1、實驗一、分離鑒定植物組織中的氨基酸目的意義目的意義層析分離技術(shù)（或稱色層分析技術(shù)）是一種物理分離技術(shù)，是利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)（如吸附力、分子大小和形狀、分子親和力、分子極性、分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不同程度分布在兩相中，達到分離的目的。根據(jù)層析方法所依據(jù)的理化性質(zhì)的不同，層析技術(shù)可分為吸附層析、分配層析、離子交換層析、排阻層析、親和層析等。根據(jù)固定相支持劑的質(zhì)地和形狀等的不同，層析技術(shù)可分為紙層析、薄層層析、薄膜層析、

2、柱層析等。層析分離技術(shù)因其操作簡便，不需要很復雜的設備，樣品用量可大可小，故既可用于實驗室的分離分析，又適用于工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)品的分離制備。它與光學儀器配合，可組成各種自動化分離分析儀器，進一步顯示了層析分離技術(shù)的優(yōu)越性。在生化技術(shù)領(lǐng)域里，層析技術(shù)已成為一項最常用的分離分析方法。此項技術(shù)可用于研究物質(zhì)組成和分離純化各種成分。通常用于分離分析氨基酸、核苷酸、糖類、激素、維生素等成分。其優(yōu)點是能夠分離與分析在組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)上極為相似的物質(zhì)，設

3、備簡單，操作容易，樣品用量少，結(jié)果較準確。本實驗目的在于掌握層析法的一般原理和操作技術(shù)，學會氨基酸的鑒定方法。一、紙層析法（一）原理（一）原理紙層析是分配層析的一種，即以分配系數(shù)的不同，使不同物質(zhì)在不同相中不同程度地分配，從而達到分離的目的。一種物質(zhì)在不同的溶劑中具有不同的溶解度。所謂分配系數(shù)就是一種溶質(zhì)在兩種存在于同一系統(tǒng)而相互不溶的溶劑中溶解達到動態(tài)平衡時，溶質(zhì)在兩相中的濃度比值，通常用表示：?溶劑中溶質(zhì)的濃度溶劑中溶質(zhì)的濃度ba?

4、?各種物質(zhì)的分配系數(shù)在一定條件下是一個常數(shù)。將兩種溶劑中的一相用一種支持劑加以固定，稱為固定相。讓另一相從這相上流過，稱為流動相。這樣，分配系數(shù)可表示為：流動相中溶質(zhì)的濃度固定相中溶質(zhì)的濃度??紙層析是以濾紙作支持劑的分配層析。層析溶劑是選用有機溶劑和水組成的。由于濾紙纖維與水有較強的親和力，能吸附22％左右的水，而與有機溶劑的親和力很弱，它可以在紙的毛細管中流動。因此，以水作固定相，而以與水不相溶的有機溶劑作流動相。層析時，將濾紙的一

5、端浸入展層劑中，有機溶劑就會連續(xù)不斷地通過點有樣品的原點處，使其中的溶質(zhì)依據(jù)其本身的分配系數(shù)不斷地在兩相間進行分配。分配的過程：一部分溶質(zhì)隨有機相移動離開原點而進入無溶質(zhì)區(qū)，并進行重新分配，即一部分溶質(zhì)從有機相又進入水相。隨著有機相不斷向前移動，溶質(zhì)不斷地在兩相間進行可逆的分配，不斷向前移動。各種物質(zhì)因其分配系數(shù)的不同，在兩相間分配的數(shù)量就不同，分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中分配的數(shù)量多，向前移動的速度快；而分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相中分配的

6、數(shù)量多，移動的速度慢。所以各種溶質(zhì)在層析的過程中由于移動的速度不同便可以彼此分開。層。把欲分離的樣品點在薄層上，然后用適宜的溶劑展開，使混合物得以分離的方法。由于層析在薄層上進行故而得名。是一種微量、快速的層析方法。它不僅可以用于純物質(zhì)的鑒定，也可用于混合物的分離、提純及含量的測定。還可以通過薄層層析來摸索和確定柱層析時的洗脫條件。薄層層析的作用機理主要包括吸附、分配、離子交換和凝膠過濾等作用。當樣品組分在薄板上進行分離時，這幾種作用產(chǎn)

7、生不同的影響，究竟哪種作用為主，須視情況而定。在吸附薄層層析中，因樣品組分極性有差異，故不同組分與吸附劑和展層劑的親和力就有差別，從而導致各組分在薄板上的移動距離不同，組分與吸附劑親和力強的留在接近原點的位置；反之，組分與吸附劑親和力弱的留在離原點較遠的位置，即親和力愈弱，移動愈遠，于是樣品中各組分就得到分離。按照相似溶解相似規(guī)律，極性組分易溶于極性溶劑中；非極性組分則易溶于非極性溶劑中，因此在同一薄板上，不同極性化合物的組分在同一溶劑

8、中的溶解度不同，溶解度愈大，移動的速度愈快；否則反之。展層的過程即樣品各組分得到分離的過程，它也是一個吸附，解析，再吸附，再解析的連續(xù)過程。同一種物質(zhì)具有相同的Rf值，不同物質(zhì)有不同的Rf值，因而達到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標準氨基酸進行對比，就可以鑒定樣品中各種氨基酸的種類，從顯色斑點顏色的深淺和大小可以確定氨基酸的含量。（二）實驗材料、儀器與試劑（二）實驗材料、儀器與試劑1.實驗材料：綠豆芽。2.儀器:薄層涂布器、研缽

9、、試管、烘箱、真空干燥器、微量注射器、玻璃缸、噴霧器等。3.試劑：（1）展開劑Ⅰ：甲酸：叔丁醇：甲乙酮：氨水：水（5：3：1：1，V／V）。（2）展開劑Ⅱ：異丙醇：甲酸：水（20：1：5，V／V）。注意：以上兩種展開劑臨用時配。（3）05％茚三酮丙酮溶液。（4）羧甲基纖維素或微晶纖維素。（5）標準氨基酸（2mg／mL）。（三）操作步驟（三）操作步驟（1）薄層板制備：稱取10g微晶纖維素，加入20mL蒸餾水和2.5mL丙酮，研磨1min用

10、薄層涂布器涂布于干凈的玻璃板上。其厚度以300～500?m為適(比一般薄板厚一些），涼干后即可使用。（2）樣品液制備：稱取樣品5mg，放入小試管中，加入5.7N鹽酸（恒沸點鹽酸）0.6mL。在火焰上熔融封口后，置于110℃烘箱中水解24h。取出，打開封口于真空干燥器中減壓抽干，以去掉過多的鹽酸，以稀氨水調(diào)節(jié)至Ph7左右，加入10％異丙醇最后達0.5mL，置于冰箱中備用。（3）點樣：用微量注射器取樣液5?lspl，滴加在距薄板下邊2cm處

11、，點樣直徑在2～3mm內(nèi)為宜。（4）展開：將已點樣的薄板，放入有展開劑Ⅰ的玻璃缸里，先進行堿向展開，當溶劑前沿到達10cm時（約60～80min），將薄板取出，冷風吹干。再進行酸向展開，將薄板放入有展開劑Ⅱ的玻璃缸中，展開至距離原點10cm時，取出吹于。(5)顯色；以0.5％茚三酮液噴霧于薄層板上，噴得薄板濕潤并無液滴流下。將薄板吹干，有氨基酸的地方顯出藍紫色斑點，只有脯氨酸為黃色斑點。用筆將斑點圈出或用描圖紙復繪保存。（6）標準氨基酸