化學(xué)發(fā)光原理

1、簡(jiǎn)介上世紀(jì)70年代中期Arakawe首先報(bào)道CLIA，發(fā)展至今已經(jīng)成為一種成熟的、先進(jìn)的超微量活性物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，應(yīng)用范圍廣泛，近10年發(fā)展迅猛，是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法，也是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，可以完全替代放射免疫分析、徹底淘汰酶聯(lián)免疫分析。主要具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、試劑價(jià)格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期（618個(gè)月）、方法穩(wěn)定快速、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)單自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。高

2、靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)以被廣大研究人員所認(rèn)可，并正逐漸替代傳統(tǒng)的生物檢測(cè)技術(shù)。化學(xué)發(fā)光與放射免疫法是公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物和各種激素最精確和最成熟的檢測(cè)方法，二者的原理、技術(shù)與方法早已成熟并被國(guó)外各大醫(yī)院用于腫瘤檢測(cè)和激素檢測(cè)，二者的試劑與儀器均通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證與我國(guó)藥監(jiān)局的批準(zhǔn)。但是，放射免疫分析法雖有很高的靈敏度，卻存在放射性防護(hù)和同位素污染的問(wèn)題，況且試劑價(jià)格昂貴只有一個(gè)有保質(zhì)期，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)難以普及。化學(xué)放光免疫分析儀繼承了放射

3、免疫的所有優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了放射免疫和酶聯(lián)免疫各自的缺點(diǎn)，是臨床免疫檢測(cè)最理想的新方法?？梢钥隙ǖ恼f(shuō)，她將取代放射免疫和酶聯(lián)免疫成為臨床免疫檢測(cè)最理想的新技術(shù)。[1]2原理化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)同時(shí)發(fā)射出光子(hM)利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)

4、劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體)直接標(biāo)記在抗原(化學(xué)發(fā)光免疫分析)或抗體(免疫化學(xué)發(fā)光分析)上或酶作用于發(fā)光底物。3類型化學(xué)發(fā)光免疫分析法以標(biāo)記方法的不同而分為兩種:(1)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法(2)酶標(biāo)記、以化學(xué)發(fā)光底物作信號(hào)試劑的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物——acridiniumeste

5、r(AE)是有效的發(fā)光標(biāo)記物[3]其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑(NaOH2H2O2)作用而酮以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。ALP標(biāo)記的CLEIA所用底物為環(huán)122二氧乙烷衍生物這是一類很有前途的發(fā)光底物用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計(jì)的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的基團(tuán)——金剛烷基其分子中發(fā)光基團(tuán)為芳香基團(tuán)和酶作用的基團(tuán)在酶及起動(dòng)發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。最常使用的底物是AMPPD[32(2’2spiroadaman2tane)42me

6、thoxy242(3’2phosphoryloxy)2phenyl2122dioxetane]中文名為:32(2’2螺金剛烷)242甲氧基242(3’2磷酰氧基)2苯基2122環(huán)二氧乙烷)。在堿性磷酸酶(ALP)作用下磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個(gè)磷酸基得到一個(gè)中等穩(wěn)定的中間體AMPD(半壽期為2～30min)此中間體經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)產(chǎn)生470nm的光可持續(xù)幾十分鐘

7、(如圖5)。AMPPD為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物可用來(lái)檢測(cè)堿性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結(jié)合物?？蓹z測(cè)到堿性磷酸酯酶的濃度為1015molL。美國(guó)DPC公司的Immulite全自動(dòng)酶放大發(fā)光免疫分析儀以堿性磷酸酶為標(biāo)記物以金剛烷作發(fā)光底物測(cè)定靈敏度相當(dāng)于1021molmL的酶采用聚苯乙烯珠作載體其檢測(cè)水平已能達(dá)到1012gmL。化學(xué)發(fā)光免疫分析儀是通過(guò)檢測(cè)患者血清從而對(duì)人體進(jìn)行免疫分析的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)儀器。將定量的患者血清和辣

8、根過(guò)氧化物（HRP）加入到固相包被有抗體的白色不透明微孔板中，血清中的待測(cè)分子與辣根過(guò)氧化物酶的結(jié)合物和固相載體上的抗體特異性結(jié)合。分離洗滌未反應(yīng)的游離成分。然后，加入魯米諾Luminol發(fā)光底液，利用化學(xué)反應(yīng)釋放的自由能激發(fā)中間體，從基態(tài)回到激發(fā)態(tài)，能量以光子的形式釋放。此時(shí)，將微孔板置入分析儀內(nèi)，通過(guò)儀器內(nèi)部的三維傳動(dòng)系統(tǒng)，依次由光子計(jì)數(shù)器讀出各孔的光子數(shù)。樣品中的待測(cè)分子濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量分析。最后，打印數(shù)據(jù)報(bào)告

9、，以輔助臨床診斷?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)概要一前言化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence)是指某些化學(xué)反應(yīng)中發(fā)出可見(jiàn)光現(xiàn)象。最早發(fā)現(xiàn)的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象發(fā)生在生物體內(nèi)，發(fā)光生物體廣泛存在于自然界，大約有13大類近千種。1902年Schmitz最早合成的魯米諾發(fā)光試劑被廣泛用于血跡鑒定工作。國(guó)外化學(xué)發(fā)光分析方面的研究在20世紀(jì)六七十年代得到迅速發(fā)展，直到現(xiàn)在，化學(xué)發(fā)光分析的研究和應(yīng)用仍然是痕量分析領(lǐng)域的一個(gè)十分重要的研究方向。我國(guó)的化學(xué)發(fā)光

10、研究工作起步比較晚，到20世紀(jì)70年代后期才有介紹文章，80年代才有原始性的研究報(bào)道。在過(guò)去的20多年中，我國(guó)的化學(xué)發(fā)光從無(wú)到有，從小到大，從國(guó)內(nèi)走向國(guó)際，2004年9月第十一屆發(fā)光光譜分析國(guó)際會(huì)議在北京召開，標(biāo)志著我國(guó)的化學(xué)發(fā)光研究走上了一個(gè)新的臺(tái)階。隨著光電轉(zhuǎn)換技術(shù)的提高和計(jì)算機(jī)的普及和使用，化學(xué)發(fā)光儀器性能獲得空前的提高，化學(xué)發(fā)光的研究和應(yīng)用得到快速的發(fā)展，特別是在臨床檢驗(yàn)和環(huán)境檢測(cè)方面已經(jīng)成為不可缺少的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)