電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

1、電化學(xué)發(fā)光免疫分析法,11月 劉博,免疫分析法發(fā)光和化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光免疫分析法電化學(xué)發(fā)光電化學(xué)發(fā)光免疫分析法甲狀腺功能介紹,免疫分析,基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段；免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過(guò)這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。,免疫學(xué)檢測(cè)歷史演進(jìn),放射免疫檢測(cè)（現(xiàn)仍普遍使用于縣級(jí)以上醫(yī)院

2、）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)（各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù),發(fā)光分類(lèi),光照發(fā)光:發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光（熒光）。生物發(fā)光：指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，比如螢火蟲(chóng)的發(fā)光，反應(yīng)底物熒光素在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素，后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出?；瘜W(xué)發(fā)光（生物體內(nèi)各種現(xiàn)象都與化學(xué)反應(yīng)有關(guān)，都屬于化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象

3、）,化學(xué)發(fā)光,化學(xué)發(fā)光是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象，某些特殊的化學(xué)反應(yīng)中，反應(yīng)的中間體或產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)釋放的化學(xué)能而處于電子激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回到基態(tài)時(shí)以發(fā)射光子的形式釋放能量。,化學(xué)發(fā)光分析,根據(jù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一時(shí)刻的發(fā)光強(qiáng)度或反應(yīng)的發(fā)光總量來(lái)確定反應(yīng)中相應(yīng)組分含量的分析方法，稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光分析。,化學(xué)發(fā)光分析優(yōu)點(diǎn),化學(xué)發(fā)光具有熒光的特異性，同時(shí)不需要激發(fā)光，就避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響有很高的靈敏度，并且不像放

4、射分析那樣存在環(huán)境污染和健康危害,化學(xué)發(fā)光分析缺點(diǎn),雖然化學(xué)發(fā)光具備很高的特異性和很小的干擾，但化學(xué)分析本身的不特異性，制約了整個(gè)方法的使用。,化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）,CLIA是將化學(xué)發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新的免疫分析技術(shù)。這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性。,化學(xué)發(fā)光免疫分析（ CLIA）分類(lèi),按標(biāo)志物的不同及反應(yīng)原理的不同分為直接化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 電化學(xué)發(fā)光免疫分

5、析,電化學(xué)發(fā)光,電化學(xué)發(fā)光（ECL）是通過(guò)在電極上施加一定的波形電壓或電流信號(hào)進(jìn)行點(diǎn)解反應(yīng)的產(chǎn)物之間或與體系中共存組反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的現(xiàn)象,定義:指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)特點(diǎn)： 反應(yīng)在電極進(jìn)行 化學(xué)發(fā)光劑：三聯(lián)吡啶釕 電子供體為：三丙胺,電化學(xué)發(fā)光劑,電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLI),ECLI是繼EIA、RIA、FIA、時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)之后的新一代標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)； ECLI是電化

6、學(xué)發(fā)光(ECL)和免疫測(cè)定相結(jié)合的產(chǎn)物；ECLI是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)之一。,ECLI原理,在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記Ab(Ag),通過(guò)Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的Ag或Ab進(jìn)行定量或定性分析。,,ECLIA特點(diǎn),三聯(lián)吡啶釕在電場(chǎng)中不斷得到電子，可持續(xù)發(fā)光，信號(hào)強(qiáng)度高，容易測(cè)定容易控制三聯(lián)吡啶釕直接標(biāo)記抗原或抗體，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)志物

7、的理化特性試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好,ECLIA優(yōu)越性,高度敏感，可達(dá)pg／ml或pmol水平；特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，CV＜5％。測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。試劑靈敏度高，穩(wěn)定性好，無(wú)毒害，無(wú)污染，有效期長(zhǎng)，達(dá)數(shù)月甚至數(shù)年。操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，易于自動(dòng)化。,臨床應(yīng)用,由于該技術(shù)無(wú)放射性污染，同時(shí)有放射免疫測(cè)定的靈敏度，且具有快速、準(zhǔn)確、特異、可自動(dòng)化等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于以下幾個(gè)方面:激素:甲狀腺激素、生殖激素、垂體激素和皮質(zhì) 激

8、素腫瘤標(biāo)記物:AFP、CEA、PSA、CA199、CA125、CA153等貧血因子:VB12、葉酸、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等糖尿病:胰島素、血清C-肽、血漿胰高血糖素等,感染性疾病:衣原體抗體、弓形蟲(chóng)抗體、風(fēng)疹病毒抗體等其它如一些心臟標(biāo)志物、病毒標(biāo)志物、治療藥物的監(jiān)測(cè)等,甲狀腺功能項(xiàng)目： 促甲狀腺素（TSH）、 游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、 游離甲狀腺素(FT4)、 三碘甲狀腺原氨酸（T3）、 甲狀腺素（T4）、 抗

9、甲狀腺球蛋白抗體（Anti-TG)、 抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（Anti-TPO)。,游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）,介紹：T3是由甲狀腺濾泡細(xì)胞合成及分泌的激素。FT3約占T3的0.5%,能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入組織細(xì)胞，發(fā)揮生理效應(yīng)，其濃度與組織中的三碘甲狀腺原氨酸濃度一致，也與機(jī)體代謝狀態(tài)一致，對(duì)非甲狀腺疾病也有診斷價(jià)值。臨床意義： 增高：見(jiàn)于甲亢、三碘甲狀腺原氨酸型甲狀腺功能亢進(jìn)。 降低：見(jiàn)于甲狀腺功能減退。正常參考

10、值：2.0-4.4pg/ml,游離甲狀腺素（FT4）,介紹：血清游離甲狀腺素是甲狀腺功能體外試驗(yàn)的靈敏指標(biāo)，即使在生理情況下引起血漿甲狀腺素結(jié)合蛋白結(jié)合力和濃度改變時(shí)，也能較準(zhǔn)確反映甲狀腺的功能。臨床意義： 增高：甲狀腺中毒癥、突眼性甲狀腺功能亢進(jìn)癥、無(wú)痛性甲狀腺炎伴甲亢、亞急性甲狀腺炎伴甲亢、甲狀腺制劑服用過(guò)量、甲狀腺受體不應(yīng)癥、慢性甲狀腺炎伴甲亢。 降低：甲狀腺功能減退(原發(fā)性)、垂體性或者無(wú)痛性亞急性甲狀腺炎的

11、一過(guò)性功能減退期、低白蛋白血癥。 正常參考值：0.93～1.70ng／dL,促甲狀腺激素（TSH）：,介紹：促甲狀腺激素是腺垂體分泌的促進(jìn)甲狀腺的生長(zhǎng)和機(jī)能的激素，具有促進(jìn)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增生、甲狀腺激素合成和釋放的作用。臨床意義： 增高：原發(fā)性甲狀腺功能減退、伴有甲狀腺功能低下的橋本病、亞急性甲狀腺炎恢復(fù)期。攝人金屬鋰、碘化鉀、促甲狀腺激素釋放激素可使促甲狀腺激素增高。 降低：垂體性甲狀腺功能低下、非促甲狀腺激素

12、瘤所致的甲狀腺功能亢進(jìn)，以及攝入阿司匹林、皮質(zhì)激素及靜脈使用肝素可使促甲狀腺激素降低。正常參考值：0.27～4.20uIU／mL,總?cè)饧谞钕僭彼?TT3)：,介紹：10%～20%T3由甲狀腺合成與釋放，80%～90%來(lái)自于周?chē)M織T4的脫碘轉(zhuǎn)化成T3。T3為主要發(fā)揮生物活性的甲狀腺激素。血清中T3的絕大多數(shù)(99.5%)與血漿中特異蛋白結(jié)合，僅極少數(shù)處于游離狀態(tài)(0.5%)。血清中TT3濃度的改變，表示甲狀腺功能的異常，TT3濃度

13、的改變常和TT4平行，但有時(shí)存在差異，如T4型甲亢，TT3則正常。因此，臨床上常同時(shí)測(cè)定TT3和TT4值。臨床意義：增高：TT3是診斷甲狀腺功能亢進(jìn)(甲亢)最靈敏的指標(biāo)，甲亢時(shí)TT3可高出正常值4倍；同時(shí)TT3是診斷T3型甲亢的特異性指標(biāo)。降低：常見(jiàn)于甲狀腺功能減低(甲減)。正常參考值：血清TT3值與年齡有關(guān)，出生后TT3水平高于正常成人，5歲后隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降，老年人TT3常低于正常人。成人：0.73～2.88ng/ml。,

14、總甲狀腺激素(TT4)：,介紹：TT4是甲狀腺分泌的主要產(chǎn)物，也是構(gòu)成下丘腦-垂體前葉-甲狀腺調(diào)節(jié)系統(tǒng)完整性不可缺少的成份。TT4測(cè)定可用于甲亢、原發(fā)性和繼發(fā)性甲減的診斷以及TSH抑制治療的監(jiān)測(cè)。臨床意義： 增高：甲亢，急性甲狀腺炎，亞急性甲狀腺炎，急性肝炎，肥胖癥，應(yīng)用甲狀腺激素時(shí)，進(jìn)食富含甲狀腺激素的甲狀腺組織等。 降低：甲減，全垂體功能減退癥，下丘腦病變，劇烈活動(dòng)等。正常參考值：5.10-18.00ug/dl,

15、抗甲狀腺過(guò)氧化物酶自身抗體 （TPOAb） ：,介紹：甲狀腺過(guò)氧化物酶是甲狀腺微粒體的主要抗原成分，其功能與甲狀腺素的合成有關(guān)?？辜谞钕龠^(guò)氧化物酶抗體或抗甲狀腺微粒體抗體可能使甲狀腺細(xì)胞損傷。檢測(cè)抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體的方法與抗甲狀腺球蛋白抗體類(lèi)似。測(cè)定抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體的臨床意義與抗甲狀腺球蛋白抗體也大致相同，主要對(duì)于慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥，有輔助診斷、療效考核價(jià)值。 臨床意義：橋本

16、(Hashimoto)甲狀腺炎患者血清中ATG檢出率可達(dá)90%～95%;甲狀腺功能亢進(jìn)患者檢出率40%～90%不等，檢出率高的可能與部分病例屬于橋本甲亢有關(guān);原發(fā)性甲狀腺功能低下癥患者檢出率65%左右。 參考值：0.00-34.00IU/mL,抗甲狀腺球蛋白抗體（Anti-TG),介紹：甲狀腺球蛋白是一種潛在的自身抗原，當(dāng)進(jìn)入血液后可刺激機(jī)體產(chǎn)生Anti-TG抗體。 Anti-TG，測(cè)定有助于診斷自身免疫疾病。臨床意義：在

17、自身免疫性甲狀腺炎患者中可發(fā)現(xiàn)Anti-TG抗體濃度升高出現(xiàn)頻率大約是70%-80%。Graves病Anti-TG抗體的陽(yáng)性率約60%，經(jīng)治療后滴度下降提示治療有效。甲亢病人測(cè)Anti-TG陽(yáng)性且滴度較高，提示抗甲狀腺藥物療效果不佳，且停藥后易復(fù)發(fā)。參考值：0.00-115.00IU/ml,異常值處理：,TSH>10uUI/ml 時(shí)應(yīng)進(jìn)行1：10稀釋重做。TPO>600IU/ml時(shí)應(yīng)進(jìn)行1：5稀釋重做。出現(xiàn)單個(gè)項(xiàng)目過(guò)高