化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)概要

1、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù),姓名：龐瀟卿專業(yè)：生化與分子生物學(xué),目錄,,發(fā)光及化學(xué)發(fā)光的原理與分類,,化學(xué)發(fā)光劑及其作用原理,,化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理與操作,,應(yīng)用與發(fā)展前景,,發(fā)光：是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。,,,,基態(tài)v0,激發(fā)態(tài)v,,能量,,,h.v,普朗克公式，能量?=h.vh為普朗克常數(shù)，v為頻率,發(fā)光,,發(fā)光的分類,光照發(fā)光,是指發(fā)光劑（熒

2、光素）經(jīng)短波長(zhǎng)的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見光（熒光）。,生物發(fā)光,是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象。如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來(lái)。,化學(xué)發(fā)光,是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)（發(fā)光劑）在化學(xué)反應(yīng)時(shí)吸收了反應(yīng)過程中的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍

3、遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量的現(xiàn)象。,,根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來(lái)源不同可分為:,,間接化學(xué)發(fā)光,直接化學(xué)發(fā)光,,化學(xué)發(fā)光,A + B C* C* C + h.v,A + B C* C* + D C + D* D* D + h.v,化

4、學(xué)發(fā)光的原理,,,,,,,,,,,化學(xué)發(fā)光的分類,酶促化學(xué)發(fā)光： 辣根過氧化物酶-魯米諾（HRP-Luminol）系統(tǒng) 堿性磷酸酶（ALP）系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學(xué)發(fā)光： 吖啶酯系統(tǒng) 草酸酯系統(tǒng),閃光（Flash）：,發(fā)光時(shí)間在數(shù)秒內(nèi)，如吖啶酯,輝光（Glow）：,發(fā)光時(shí)間在數(shù)十分鐘以上，如： HRP-Luminol系統(tǒng) 二氧雜環(huán)乙烷AP發(fā)光（AP-AMPPD）

5、系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng),按化學(xué)反應(yīng)類型,按發(fā)光持續(xù)時(shí)間,,,,,在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物?？煞譃橹苯踊瘜W(xué)發(fā)光劑和酶促反應(yīng)發(fā)光劑。,,化學(xué)發(fā)光劑,能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：①發(fā)光的量子產(chǎn)率高；②它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的 物質(zhì)相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物； ④其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果；⑤在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒有毒性。

6、,直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需要酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。,,（一）直接化學(xué)發(fā)光劑,,1. 吖啶酯 2. 三聯(lián)吡啶釕,吖啶酯 在堿性條件下被H2O2氧化時(shí)，發(fā)出波長(zhǎng)為470 nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物 N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。,,,,,利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光

7、劑。,（二） 酶促反應(yīng)發(fā)光劑：,1. 魯米諾 2. AMPPD,魯米諾（Luminol）發(fā)光原理,,,辣根過氧化酶,文字內(nèi)容,魯米諾（Luminol）增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理,,雙負(fù)離子,,鐵氰化鉀催化H2O2產(chǎn)生O2,,3-氨基-鄰苯二甲酸（激發(fā)態(tài)）,,過氧化物不穩(wěn)定，分解產(chǎn)生N2,化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immunoass- ay,CLIA)，是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)

8、合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)分析技術(shù)。是繼放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析和膠體時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫分析技術(shù)。,化學(xué)發(fā)光免疫分析,一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析,用吖啶酯直接標(biāo)記抗體（抗原），與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分

9、解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。,直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理,--- 夾心法,,,,磁微粒模式圖,,,,,,,Y,,Y,,Y,Y,,Y,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,,特點(diǎn)抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離,磁微粒技術(shù),,磁性納米粒子與無(wú)機(jī)或有機(jī)分子結(jié)合形成的可均勻分散于一定基液中具有高度穩(wěn)定性的膠態(tài)復(fù)合材料,二、化學(xué)

10、發(fā)光酶免疫分析,化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（ALP）來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們

11、傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。,此處添加內(nèi)容,該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體（或抗原），在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。,,辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析,辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖,,,待測(cè)樣品,標(biāo)記抗體或抗原（磁顆粒）,,,,在磁場(chǎng)中洗滌去除未結(jié)合

12、的反應(yīng)物,,,,,,,,,發(fā)光底物,,儀器檢測(cè),包被抗體或抗原的反應(yīng)管,,反應(yīng)30-60分鐘,反應(yīng)0-5分鐘,,,,,,,基本操作步驟,化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,,優(yōu)點(diǎn),1.靈敏度高 ：CLIA關(guān)鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達(dá)10-16mol/L(RIA為10-12mol/L) 。2.寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍 ：發(fā)光強(qiáng)度在4～6個(gè)量級(jí)之間與測(cè)定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。 3.光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng) ：輝光型的CLIA產(chǎn)生的光信號(hào)持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至一天，簡(jiǎn)化

13、了實(shí)驗(yàn)操作及測(cè)量。 4.分析方法簡(jiǎn)便快速 ：絕大多數(shù)分析測(cè)定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步模式。 5.結(jié)果穩(wěn)定、誤差小：樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠6.安全性好及使用期長(zhǎng) ：免除了使用放射性物質(zhì)。,,,,,,,,,,,,單光子計(jì)數(shù)器,,,,,,,,光電倍增管,,,,,,,,,,,,高壓,,高速放大器,高速比較器,高速分頻器,發(fā)光樣品產(chǎn)生光子,,,激發(fā)光陰極產(chǎn)生光電子,,,在陽(yáng)極上形成較

14、強(qiáng)信號(hào),脈沖信號(hào),相對(duì)發(fā)光單位數(shù)字脈沖(RLU),,,,,,,,在各打拿極之間得到能量和數(shù)目的倍增,化學(xué)發(fā)光免疫分析儀核心部件,化學(xué)發(fā)光免疫分析的應(yīng)用（一）,①肺結(jié)核病常以人體血清中CA125 含量為疾病標(biāo)記物，Wang 等建立了CA125 的毛細(xì)管化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)肺結(jié)核病的檢測(cè)。 ②Knight 等采用化學(xué)發(fā)光免疫夾心分析方法對(duì)梅毒病毒進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的分析方法快速血漿素反應(yīng)（RPR）和酶免疫分析方法（ELI S

15、A）進(jìn)行比較，通過對(duì)多種樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與RPR 及ELISA分析方法結(jié)果相比有 99.1％的正確率。 ③甲胎蛋白（AFP）為腫瘤疾病標(biāo)志物，Zhang 等利用磁性微粒子和包被小管建立了AFP 的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法。在該方法中，AFP抗體首先包被于兩種不同的固相載體上，如磁性微粒子和包被小管，再分別對(duì)這兩種包被模式建立的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法進(jìn)行比較。通過再抗體包被濃度、標(biāo)記于抗體上HRP 的稀釋比例、分析所需時(shí)間、化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)等

16、角度進(jìn)行衡量，顯示磁性微粒子具有較大的優(yōu)勢(shì)。,,醫(yī)學(xué)檢測(cè),化學(xué)發(fā)光免疫分析的應(yīng)用（二）,①Q(mào)uan 等建立了食品中伏馬菌素B1 的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，與伏馬菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法靈敏度提高了10 倍。且通過樣品的添加回收率試驗(yàn)表明其有良好的回收率，其分析結(jié)果與ELISA 分析方法與 HPLC 方法有良好的相關(guān)性。 ②Yang 等建立了食品中葡萄球菌腸毒素B（SEB）的碳納米管的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，通過將S

17、EB 抗體吸附在碳納米管表面 ，然后將抗體－碳納米管固定在聚碳酸酯表面，再通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定SEB 含量。 ③Magliulo 等建立了牛奶中黃曲霉毒素M1的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，通過將黃曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通過酶標(biāo)二抗在含有魯米諾的基板上進(jìn)行檢測(cè)。 ④Lin 等建立了農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1 的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。同時(shí)， 將建立的分析方法與黃曲霉毒素商品化酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行了相關(guān)性試驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)

18、為0.9098，顯示其有較好的應(yīng)用前景。,,食品安全檢測(cè),化學(xué)發(fā)光免疫分析的應(yīng)用（三）,①Christian 等通過化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法建立了環(huán)境內(nèi)分泌干擾物炔雌醇的免疫分析方法，并通過建立的分析方法對(duì)表面水和污水處理廠的污水中的炔雌醇進(jìn)行測(cè)定。 ②Pittman 等通過磁性小珠和生物素-親和素為載體建立了水樣和土樣中2，4，6-三硝基甲苯的免疫夾心電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。 ③Zhao 等通過建立微板式磁化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法

19、來(lái)對(duì)水樣中17 β-雌二醇進(jìn)行檢測(cè)。通過微板磁性分離器可避免前處理過程以達(dá)到高通量分析，再結(jié)合高靈敏度的化學(xué)發(fā)光體系，建立了該方法。,,環(huán)境科學(xué),發(fā)展與展望,化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測(cè)中得到了廣泛運(yùn)用。實(shí)際檢測(cè)常常需要對(duì)大量、復(fù)雜、低豐度的樣品進(jìn)行測(cè)定，因而化學(xué)發(fā)光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測(cè)的方向發(fā)展。 化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)、化

20、學(xué)發(fā)光免疫分析與分離技術(shù)的聯(lián)用，可以使免疫分析的選擇性、靈敏度、檢測(cè)速度和檢測(cè)通量得到進(jìn)一步提高。為了更好地適應(yīng)臨床、環(huán)境等領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用，需要大力發(fā)展微型化、集成化和自動(dòng)化的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器。隨著分子生物學(xué)及納米與傳感技術(shù)的進(jìn)步，新的化學(xué)發(fā)光免疫分析原理與高靈敏的免疫分析方法將得到不斷發(fā)展，開發(fā)催化活性更高、穩(wěn)定性更好、發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線更符合免疫分析的酶和底物并推廣到臨床檢測(cè)，發(fā)展新型標(biāo)記技術(shù)用于信號(hào)放大，建立化學(xué)發(fā)光免疫分析新方法

21、，都將是未來(lái)的發(fā)展方向及研究重點(diǎn)。,發(fā)展與展望,目前化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展趨勢(shì)主要表現(xiàn)在：（1）常見發(fā)光體系的不斷完善，隨著化學(xué)發(fā)光底物、氧化劑、催化劑、增敏劑及固相材料研究的不斷深入，性能更加優(yōu)異的化學(xué)發(fā)光體系將在今后研究中不斷涌現(xiàn)；（2）基因工程抗原、抗體的制備及廣泛應(yīng)用，將進(jìn)一步促進(jìn)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展；（3）化學(xué)發(fā)光免疫分析方法與包括毛細(xì)管電泳等其他方法聯(lián)用，將提高化學(xué)發(fā)光免疫分析的速度以及靈敏度，拓寬化學(xué)發(fā)光體