腫瘤動物模型和抗腫瘤藥物的研究方法

1、1,第四章腫瘤動物模型和抗腫瘤藥物的研究方法,2,˙惡性腫瘤——常見病、多發(fā)病˙全世界每年700萬死亡；占?xì)W美死亡第二位˙我國城市居民第一位，農(nóng)村第三位˙惡性腫瘤人類健康重要——?dú)⑹?進(jìn)展較大, 疑難問題很多。腫瘤動物模型和抗腫瘤研究方法具有重要意義。,3,4,腫瘤動物模型可分為三類：,自發(fā)性腫瘤動物模型誘發(fā)性腫瘤動物模型移植性腫瘤動物模型,5,第一節(jié) 自發(fā)性腫瘤動物模型,(animal model of sponta

2、neous tumors),概念: 未經(jīng)人為處理；自然發(fā)生,? 自發(fā)性乳腺癌模型? 自發(fā)性白血病模型,6,一、自發(fā)性乳腺癌模型,生長在體表,易早期發(fā)現(xiàn),罕有自發(fā)消退,因而能準(zhǔn)確觀察其大小與生長速度,便于進(jìn)行實驗。,,7,現(xiàn)介紹三種自發(fā)性乳腺癌小鼠模型,C3H小鼠：繁殖用雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為 85%~100%。,,A系小鼠： 經(jīng)產(chǎn)雌鼠乳腺腫瘤發(fā)生率為30%~80%。,CBA小鼠：雌鼠自發(fā)性乳腺癌發(fā)生率為60%

3、~65%。,8,在乳腺左右兩側(cè)及乳頭部均可發(fā)生腫瘤。每只小鼠常見1個以上腫瘤。選擇腫瘤數(shù)目和大小相近的動物, 配對分組,給予受試藥,觀察受試藥對腫瘤發(fā)展的影響。,給藥方案和給藥途徑可根據(jù)受試藥物的特點(diǎn)確定。因自發(fā)性乳腺癌發(fā)展較緩慢，故采用間歇給藥或小劑量連續(xù)給藥較為合適。,9,[結(jié)果判定],給藥后每天觀察腫瘤生長情況，記錄發(fā)生時間和位置。,腫瘤結(jié)節(jié)長到一定程度,每周用腳規(guī)測量皮下腫瘤2次。測定腫塊的最大徑(a)和最小徑(b)。

4、腫瘤體積(cm3) = ab2/2,10,將腫瘤體積變化對時間作出生長曲線,可由曲線的斜率變化判斷藥物抑制腫瘤生長的作用,尤其應(yīng)觀察腫瘤能否完全消退。,11,[注意事項]1.在同一品系內(nèi),發(fā)病率比較穩(wěn)定,而不同品系間差別甚大。 2.動物乳腺癌發(fā)生與遺傳基因、乳癌因子(即致乳癌病毒)及激素有關(guān)。,3.飼料的變更有明顯影響,要用固定全價營養(yǎng)飼料。 4.配對分組。,12,二、AKR白血病模型 AKR小鼠為白血病高發(fā)品系，淋巴細(xì)胞白

5、血病發(fā)病率雄性76%~90%，雌性為68%~90%。,[操作步驟] 實驗用6~12月齡AKR小鼠, 此時鼠的脾和淋巴結(jié)腫大, 血象異常。 經(jīng)血液檢查確診為白血病后的次日, 配對分組并開始給予受試藥, 觀察結(jié)果。,,13,觀察指標(biāo)：末梢血象,白細(xì)胞數(shù),淋巴結(jié)和脾大小,動物生存時間。有效者生存期比對照組延長, 并根據(jù)血象評價藥物的誘導(dǎo)緩解和維持緩解作用。,各鼠白血病的病程不一,自發(fā)瘤確診后, 實驗時應(yīng)配對分組。,[結(jié)果判定],

6、[注意事項],14,[自發(fā)性腫瘤的總體評價],動物自發(fā)性腫瘤的病因往往是由動物的遺傳特性決定的,與人癌的病因有較大距離。,各動物腫瘤生長速度差異較大, 很難在限定時間內(nèi)獲得大量生長均勻的荷瘤動物(tumor-bearing animals),因此，自發(fā)性腫瘤動物模型很少在抗腫瘤藥物的常規(guī)篩選中廣泛應(yīng)用。,15,第二節(jié) 誘發(fā)性腫瘤動物模型,(animal models of induced tumor),概念: 在實驗條件下;

7、 使用致癌物(carcinogens); 誘發(fā)動物發(fā)生腫瘤,16,[基本原理],利用外源性致癌物引起細(xì)胞遺傳特性改變，從而出現(xiàn)異常生長和高增殖活性細(xì)胞,形成腫瘤。 外源性致癌物主要有化學(xué)性、物理性(如放射性物質(zhì))及生物性(如誘發(fā)動物腫瘤的病毒),其中以化學(xué)性致癌物最為常用。,17,一、誘發(fā)性腫瘤動物模型的基本方法,實驗時,必需注意選擇合適的致癌方法、動物種系、致癌物及其溶劑、給予劑量、途徑以及

8、觀察時間等。致癌物的劑量應(yīng)能保證動物的存活率較高、誘發(fā)期較短和誘發(fā)腫瘤頻率較高。,18,常用的致癌物給予方法和途徑,1.涂抹法: 涂抹在背部及耳部皮膚,主要用于誘發(fā)皮膚腫瘤。,2.經(jīng)口給藥法：通過飲水、飼料或灌喂動物。常用于食道癌、胃癌及大腸癌等。,3.注射法：致癌物制成溶液,經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈或體腔等途徑注入體內(nèi),本法較常用。,19,常用的致癌物給予方法和途徑,4.氣管注入法：常用于誘發(fā)肺癌。,5.穿線法：將致癌物置于無菌試管內(nèi),加熱

9、使之液化,吸附于預(yù)制的線結(jié)上,再將此線結(jié)穿入靶組織而誘發(fā)腫瘤。,6.埋藏法：包埋于皮下或其他組織內(nèi)。,20,二、誘發(fā)性腫瘤模型的動物和致癌物,動物：大鼠，小鼠，犬等致癌物：多環(huán)碳?xì)漕悂喯醢奉惻嫉慄S曲霉毒素 （飼料中含0.001~0.015ppm黃曲霉毒素B1, 喂養(yǎng)6個月,誘發(fā)大鼠肝癌）。 ppm = parts per million,21,22,[誘發(fā)性腫瘤模型的總體評價],約80%人癌是由環(huán)境因素引起的, 誘發(fā)性

10、腫瘤的病因與人癌的情況近似, 且均經(jīng)過較長演變過程而成瘤。動物誘發(fā)性腫瘤是比較類似于人類腫瘤的動物模型。,然而,人癌的發(fā)生原因十分復(fù)雜,往往并非由已知的動物致癌物所引起。另外,動物誘發(fā)性腫瘤的組織病理類型、發(fā)生發(fā)展過程也不一定與人癌完全一致。,23,本模型的最大困難是誘癌時間長、成癌率常達(dá)不到100%, 而且動物之間腫瘤發(fā)生時間、發(fā)展速度的個體差異很大, 難以將未治療的動物作為治療動物的對照。,24,第三節(jié)移植性腫瘤動物模型(An

11、imal model of transplanting tumors),25,移植性腫瘤動物模型是指將動物或人體腫瘤移植到同種或異種動物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成的腫瘤。,該實驗法是抗腫瘤藥物篩選最常用的體內(nèi)方法，具有重要作用。目前臨床上常用的抗腫瘤藥大多是首先經(jīng)該實驗法而被發(fā)現(xiàn)的。,26,一般給予試驗藥7~10d, 在第8~11d可解剖動物獲得結(jié)果。通過一些指標(biāo)的觀察, 可以判斷試驗藥是否有具有抑制腫瘤生長的作用。這是任何體外試驗所不能替代的

12、, 其結(jié)果可為抗癌藥物療效提供重要依據(jù)。,27,它比前述的自發(fā)性和誘發(fā)性動物腫瘤更易實施。 現(xiàn)有移植性腫瘤接種成功率可達(dá)100%, 可在同一時間內(nèi)獲得大量(數(shù)十至百余只動物)、生長相當(dāng)均勻的腫瘤。,28,移植性腫瘤常用的動物為小鼠、大鼠和地鼠。研究藥物的抗腫瘤作用可選擇三種或三種以上小鼠、大鼠的移植性腫瘤進(jìn)行實驗治療；抗腫瘤藥物篩選時，每批動物的來源應(yīng)一致；,一、動物的選擇,29,根據(jù)瘤株的特點(diǎn)選用近交系、遠(yuǎn)交系或F1動物；雌雄性動物均

13、可應(yīng)用(乳腺癌等必須用雌性動物)。 ▲每批實驗只用同一性別動物。 ▲小鼠體重18~22g，大鼠體重50~70g ▲每組至少10只動物，裸鼠可用5~10只。,30,二、腫瘤細(xì)胞的選擇,復(fù)制移植性腫瘤模型需要使用腫瘤細(xì)胞株(瘤株，tumor strain)或細(xì)胞系(cell line)。 細(xì)胞株(cell strain)是指通過選擇法或克隆法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊遺傳、生化性質(zhì)或特異標(biāo)記的細(xì)胞群。,31,瘤株

14、的組織學(xué)類型和生長特征趨于穩(wěn)定，并能在同系、同種或異種動物體內(nèi)移植并連續(xù)傳代。 生長特征，包括接種成活率、生長速度、自動消退率、宿主壽命與宿主反應(yīng)等。,細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即為細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系所組成。,32,目前，動物移植性實驗?zāi)[瘤（包括實體瘤、腹水瘤和白血?。┘s500種，還有大量人的瘤株或細(xì)胞系。常用的動物移植性腫瘤瘤株或細(xì)胞系有：,33,肉瘤S180腹水型或?qū)嶓w型艾氏腹水癌或?qū)嶓w型

15、肝癌腹水型（HepA）或?qū)嶓w型（H22） 小鼠白血病L1210、P388及L615小鼠黑色素瘤（B16） 小鼠Lewis肺癌 肉瘤S37結(jié)腸癌C38、結(jié)腸癌C26 子宮頸癌（U14）大鼠Walker癌肉瘤256（W256）,34,篩選抗癌藥物時，最好選用3類瘤株，即肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，目前最受重視和應(yīng)用最廣的是： 小鼠Lewis肺癌 小鼠黑色素瘤B16 小鼠白血病P388,瘤

16、株或細(xì)胞系的選擇應(yīng)盡量考慮與臨床擬研究腫瘤的性質(zhì)、部位等相近，如擬研究肝癌的治療，可首選肝癌瘤株。,35,一種藥物不一定對各種類型移植性腫瘤都有效，如果僅選一種瘤株進(jìn)行藥物篩選就可能出現(xiàn)漏篩。 還必須指出，動物腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)與人類腫瘤有較大差別，對動物腫瘤生長有抑制作用的藥物對人類腫瘤未必有效。,36,三、接種方法,(一)一般要求 整個操作應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，可在無菌室和超凈工作臺內(nèi)操作。動物處死后消毒皮膚，對每個實體

17、瘤應(yīng)分別使用滅菌的外科器械切取，對腹水瘤則應(yīng)分別用滅菌的注射器抽吸。,37,接種方法,瘤塊污染常是接種失敗的主要原因，應(yīng)特別注意!!在高溫季節(jié)操作時，可在盛有瘤源的器皿周圍放置冰塊直接降溫。 常用接種部位： 實體瘤_____腋窩皮下 肌肉接種___大腿肌肉 腹水型腫瘤__腹腔,38,(二)接種操作1.實體瘤,(1)基本過程（以實體瘤為例）,凍存的瘤株,--->,移入宿主體內(nèi),（瘤源動物）,-------&

18、gt;,7-10 d,(增殖),獲得瘤塊,--->,制備瘤塊,--->,給動物接種,(受體動物),39,(2)瘤塊接種法：選取接種后7~10d生長狀態(tài)良好的瘤源動物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮膚。切開皮膚，剝離出瘤塊，置于平皿上,平皿應(yīng)放置在冰塊上,內(nèi)置少許滅菌的PBS或其他營養(yǎng)液,剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長良好而無變性壞死、淡紅色、魚肉狀的瘤組織，在無菌平皿內(nèi)剪成2mm3的小塊。 黑色素瘤則呈黑色或黑紫

19、色 注意不用瘤中央的壞死部分,40,瘤源動物,--->,頸椎脫臼處死,--->,--->,消毒切開皮膚,--->,取瘤剪成 2mm3 小塊,--->,用套管針抽吸瘤塊,接種于受體動物右前肢腋窩皮下,縮短接種操作時間,從瘤塊取材到接種完畢一般應(yīng)在30min內(nèi)；平皿內(nèi)放置少許滅菌PBS或其他營養(yǎng)液；接種部位皮膚應(yīng)先消毒。,流程圖：,41,(3)瘤細(xì)胞懸液接種法 如每次需要接種的動物數(shù)量較多

20、時，可用瘤細(xì)胞懸液接種:,取幾個瘤塊,--->,除去壞死部分,--->,混合瘤塊,--->,剪成小塊,--->,勻漿器單向研勻,--->,放入無菌容器,--->,生理鹽水稀釋成1:3~1:4懸液,每只動物接種0.2ml；整個操作應(yīng)在30min內(nèi)完成；每次抽吸前應(yīng)將細(xì)胞混勻。,42,(4)培養(yǎng)細(xì)胞接種法： 對數(shù)生長細(xì)胞→胰酶消化→PBS洗滌2次→計數(shù)活細(xì)胞數(shù)→用生理鹽水稀釋成細(xì)胞懸液→細(xì)胞懸液置于

21、冰上→注射到接種部位(0.2ml,含1×106~1×107個細(xì)胞)。,43,2. 腹水型腫瘤 (1)抽取腹水：,選擇接種后7~10 d 的健康動物,頸椎脫臼處死,--->,腹部皮膚消毒,--->,剪開剝?nèi)ジ共科つw,--->,抽吸腹水,--->,放入無菌容器內(nèi),--->,若用幾只動物作為瘤源動物時,應(yīng)將腹水混合.,44,45,另取小量腹水,置于加有肝素的干試管內(nèi),作為觀察

22、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞計數(shù)用。 將空針中剩余的腹水制備推片,瑞氏染色,鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計數(shù),其中瘤細(xì)胞數(shù)應(yīng)≥95%。,抽出的腹水應(yīng)為乳白色濃稠液體,若為黃色或含有大量紅細(xì)胞時應(yīng)棄去。,46,(2)細(xì)胞計數(shù)： 取肝素管內(nèi)的瘤細(xì)胞,用生理鹽水稀釋10倍;取稀釋液0.9ml,加0.2%臺盼藍(lán)生理鹽水溶液0.1ml混勻。用血細(xì)胞計數(shù)法計數(shù)瘤細(xì)胞總數(shù)和死細(xì)胞數(shù)。 瘤細(xì)胞死亡后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，細(xì)胞可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色, 而活細(xì)胞不

23、著色。,47,48,計數(shù)計數(shù)板四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù), 計數(shù)時對壓邊線的細(xì)胞,計左不計右,計上不計下。計數(shù)四個大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù),然后按下列公式計算總細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞總數(shù)。,四大方格細(xì)胞總數(shù)－死細(xì)胞數(shù)活細(xì)胞數(shù)/ml懸液＝ ×稀釋倍數(shù)×10000

24、 4,,49,(3) 接種： 腹水用含葡萄糖的無菌Hanks液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛? 每只鼠腹腔注入0.1~0.2ml。整個操作應(yīng)在60min內(nèi)完成。,50,3. 白血病株的接種 腹水型白血病如L1210及P388的接種方法同腹水型腫瘤接種法。,51,四、腫瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 為了使腫瘤細(xì)胞能得以長期使用，防止退化或變異，保存不同代細(xì)胞的特征，對腫瘤細(xì)胞或瘤株進(jìn)行冷凍保存是很必要的。一般在液氮中凍存1~2年，細(xì)

25、胞存活率可達(dá)80%~90%。,52,1.凍存方法 取對數(shù)生長期增殖細(xì)胞，在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。經(jīng)胰蛋白酶消化、離心、洗滌，用含7份培養(yǎng)液、2份小牛血清、1份DMSO配成(1~5)×106個/ml的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入細(xì)胞凍存管，貼上標(biāo)簽，注明細(xì)胞來源、名稱及凍存日期。,53,一般將凍存管: ①4℃--30min；－20℃--4h；－70℃--過夜--然后入液氮。 ②可將凍存管懸掛液氮罐口處過夜，之后浸入液氮

26、中。 ③可用2cm厚脫脂棉將凍存管嚴(yán)密包裹,－20℃~－30℃過夜，然后除去脫脂棉直接放入液氮中。,54,2.凍存細(xì)胞的復(fù)蘇方法 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入38℃ ~ 40℃水浴中，并不停搖動使其在1min內(nèi)全部融化，500~800r/min離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)培養(yǎng)。,55,細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的原則是“慢凍快融”，標(biāo)準(zhǔn)的冷凍速度是每分鐘－1℃~－2℃，到－70℃以下時

27、可迅速放入液氮中。 所凍存的細(xì)胞必須是對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞密度應(yīng)在106個/ml以上。,56,第四節(jié)人體腫瘤異種移植性腫瘤模型,57,異種移植性腫瘤是移植性腫瘤的一種，近年很重視人體腫瘤的動物體內(nèi)移植模型。因為這種模型使用人的腫瘤細(xì)胞，在組織形態(tài)和遺傳特征等方面，均與人類腫瘤相同，故用這種模型可以比較直接研究人類腫瘤的生物學(xué)特性及抗腫瘤藥物。,58,由于異種移植的移植排斥反應(yīng)?？蓪?dǎo)致移植失敗，故選擇適合的受體動物是移植成功的

28、關(guān)鍵。常用的宿主動物主要有裸小鼠和C57BL/6小鼠，也可用免疫抑制劑或放射線等降低動物的免疫功能后，再進(jìn)行移植。,59,一、裸小鼠作為移植宿主 裸小鼠是在SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)繁殖生長的BALB/c裸小鼠，6~8周齡，體重21~22g。 [瘤源] 人體腫瘤細(xì)胞的來源大致可分為兩類，一類是人的腫瘤細(xì)胞株(系)；另一類是源于人體腫瘤組織塊的癌細(xì)胞。,常用人癌裸鼠移植的細(xì)胞株(系)、接種方式和最佳生長期見教材。,60,二、免

29、疫功能抑制的大鼠作為移植宿主 由于裸鼠嬌弱，飼養(yǎng)條件要求高，費(fèi)用昂貴，故用裸鼠復(fù)制人體腫瘤異種移植腫瘤模型較難普遍應(yīng)用。 使用免疫功能受抑制的大鼠接種人癌細(xì)胞，可獲得人癌動物模型。 先皮下注射阿糖胞苷，2d后用10Gy 60Co全身照射。,61,第五節(jié)抗腫瘤藥物體內(nèi)研究方法,62,基本步驟是: 低溫保存瘤細(xì)胞—速融—加冷培養(yǎng)液洗除凍存液—用培養(yǎng)液將腫瘤細(xì)胞調(diào)至一定濃度—給特定動物 (宿主)注射 (ip或sc)。

30、 腫瘤細(xì)胞在宿主動物體內(nèi)增殖后—取出—給實驗動物(受體動物)進(jìn)行接種(荷瘤動物)。,不同腫瘤的宿主動物、取用腫瘤的時間及接種方法見表4-1。,63,一、實體瘤(√)  [分組給藥] 接種次日將動物隨機(jī)分組：☉實驗對照組(C)：接種腫瘤細(xì)胞不給受試藥，只給受試藥相應(yīng)的溶劑☉受試藥組(T)：設(shè)高、中、低3個劑量（給藥1次或數(shù)次，給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同，靜脈給藥者可用腹腔注射代替）。 ☉

31、陽性對照藥：對瘤株活性高的已知抗腫瘤藥,64,＊對S180 , 艾氏腹水癌實體型 可用環(huán)磷酰胺20~ 30 mg /(kg .d) ＊對L615 可用5-氟尿嘧啶25mg /(kg.d) ＊對其他腹水型腫瘤一般用絲裂霉素 2mg / (kg.d) ＊對W256 可用絲裂霉素4mg/ (kg.d)+環(huán)磷酰胺20~ 30mg/(kg.d ),65,[療效評價] 停藥24h后處死動物,稱體重,剝離瘤

32、塊, 稱瘤重。受試藥物對實體瘤的療效以瘤重抑制率表示： C－T 瘤重抑制率 (%)= ×100% C 式中T:受試藥物組平均瘤重; C:實驗對照組 (模型組,荷瘤未用藥動物) 平均瘤重。 (瘤重抑制率%=[(1－T/C)]

33、5;100%計算）,,66,觀察瘤重抑制率時，要求實驗對照組小鼠瘤重均值不得低于1g（大鼠瘤重均值不得低于2g），否則表示腫瘤生長不良，實驗作廢。,給藥組動物平均體重下降（給藥前后自身比較）不得超過15%，動物死亡數(shù)不得超過20%，否則表示受試藥有毒性反應(yīng)，應(yīng)減少劑量重新實驗。,67,若中草藥瘤重抑制率大于30%，合成藥大于40%，且與實驗對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，重復(fù)3次，療效均穩(wěn)定，則評定該受試藥具有一定抗腫瘤作用。,68,[注意事

34、項] 實驗中如果幾個藥給藥組共用一個實驗對照組時，后者的動物數(shù)應(yīng)適當(dāng)增加,公式為: C＝G×M。 式中C=實驗對照組動物數(shù)；G=同時試驗的化合物數(shù)或同時試驗的藥物數(shù)；M=給藥組的動物數(shù)。 如試驗的藥物數(shù)G為2，各給藥組M均為10，故C＝2×10，實驗對照組的動物數(shù)為20。,69,二、腹水型腫瘤(√)  [分組給藥] 于接種后次日將動物隨機(jī)分組并開始給藥，受試藥設(shè)高、中、低

35、3個劑量組，口服或腹腔注射給藥，連續(xù)給藥5~10次。,70,[療效評價] 接種后觀察和記錄動物死亡時間和生存天數(shù)。實驗對照組動物通常在2~3周內(nèi)全部死亡。如實驗對照組中≥20%動物存活超過4周，表明腫瘤生長不良，實驗作廢。 如給藥治療期間實驗對照組動物于7d內(nèi)死亡率≥20%，表示腫瘤生長過快，實驗失敗。,71,腹水瘤以荷瘤動物的生命延長時間作為療效指標(biāo)，計算每組動物的平均存活時間，給藥組與實驗對照組的平均生存天數(shù)之比[(T/

36、C)%]大于125%為有效。,在接種后60d分別記錄給藥組和實驗對照組動物的平均生存時間(如果生存超過60d，按60d計算)，按下列公式計算生命延長率：,72,式中:T為受試藥物組平均生存天數(shù)； C為實驗對照組平均生存天數(shù)。,T －C 生命延長率( %)＝ ×100% C,,73

37、,若腹腔注射給藥時生命延長率＞75%，非腹腔注射給藥生命延長率＞50%，且與實驗對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)意義，重復(fù)3次，療效穩(wěn)定，則評定該受試藥具有一定抗腫瘤作用。,74,[注意事項] 1.關(guān)于幾個給藥組共用一個實驗對照組時,實驗對照組的動物數(shù)，同實體瘤。 2.實驗開始及結(jié)束時應(yīng)分別稱動物體重，若給藥組動物體重明顯低于實驗對照組時(如超過15%)，判定療效時應(yīng)注意體重降低對腫瘤生長的影響，排除非特異的毒性作用。 3.腹水型

38、腫瘤的研究方法,也適用于腹水型白血病，如L1210及P388。,75,三、移植性腫瘤研究方法的應(yīng)用 (一)肉瘤S180模型（實體瘤）(√) 小鼠肉瘤S180(sarcoma180)是經(jīng)典的動物腫瘤模型之一，在抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選中被廣泛應(yīng)用。S180有實體型和腹水型兩種生長形式，可以以一種形式傳代，實體型與腹水型可互轉(zhuǎn)。,76,[操作步驟] 1. 取接種在昆明小鼠約7~10d的S180腫瘤→剔除腫瘤包膜和壞

39、死部分→置于玻璃勻漿器內(nèi)→加入生理鹽水配制成含瘤細(xì)胞為(1~2)×107/ml單細(xì)胞懸液→ 接種于同種異體小鼠腋窩皮下, 每只小鼠注射0.2ml(含瘤細(xì)胞2×106 ~4×106個)。,77,2.接種后第1d 稱體重、隨機(jī)分組并開始給藥, 包括: ▲實驗對照組 ▲陽性對照藥組 （環(huán)磷酰胺,接種次日1次性ip,100mg/kg） ▲受試藥高劑量組 ▲

40、受試藥中劑量組 ▲受試藥低劑量組,78,腹腔注射或灌胃給藥. 給藥方案有多種。 至接種后第11~14d, 稱量動物體重, 解剖腫瘤并稱重。,79,[結(jié)果計算] S180實體瘤生長速度與接種量成正比，一般重2.5g的腫瘤需生長8~11d。根據(jù)各組動物瘤重按前述公式計算瘤重抑制率，并進(jìn)行藥物療效評定。,80,[注意事項] 1. 本方法也適用于B16、Hep、W256和C26等實體型移植性腫瘤模型。 2. 實驗結(jié)

41、束時, 陽性對照組腫瘤基本不長或長得很小, 即陽性對照組的抑瘤率應(yīng)大于80%以上, 而實驗對照組動物在此期間瘤重應(yīng)在2g左右。,,81,3.受試藥組動物體重不低于原始體重的20%,否則表示受試藥劑量過高, 需降低劑量重試。 4.腋窩部皮膚松弛，皮下接種后能允許腫瘤生長得較大，也可接種于腹股溝部皮下。,82,黑色素瘤,83,84,,模型組,陽性藥組,給藥組,85,(二)大鼠W256癌肉瘤模型(×)瓦克癌肉瘤256（Wal

42、ker256，簡稱W256）的生長有實體型和腹水型兩種形式，并可互轉(zhuǎn)。接種在皮下或肌肉內(nèi)成為實體瘤, 接種在腹腔則成為腹水瘤。在接種后開始給藥治療, 實驗結(jié)束后比較對照組與試驗組的瘤重或大鼠平均存活時間, 可判斷受試藥物的療效。,86,[操作步驟] 1.取接種于大鼠大腿肌肉或腹腔第7d、接種于皮下11~13d的W256瘤, 配制成瘤細(xì)胞懸液 (約2×106 ~4×106個瘤細(xì)胞)。取體重55~65g Wistar大

43、鼠, 雌雄不限, 每次實驗均用同一性別。每鼠大腿肌內(nèi)接種瘤細(xì)胞懸液0.2ml, 每組用6~10只動物。,,87,2.接種后第1d稱動物體重, 隨機(jī)分組并開始給藥,均用腹腔注射,每天1次, 連續(xù)7~10d,至第8~11d處死動物, 將雙側(cè)后肢從髖關(guān)節(jié)外剪下,分別稱重,荷瘤肢體重減去對側(cè)正常肢體重即為瘤重。,88,[結(jié)果計算] 按前述公式計算瘤重抑制率。 [注意事項] 1.本方法也適用于S180及艾氏腹水瘤等腫瘤。

44、2.接種的瘤源有兩種；用腹水型瘤源, 傳代6~8d 的瘤源(抽出的腹水為血性);用皮下接種的瘤, 用勻漿法制成瘤細(xì)胞懸液。,89,3.對照組肌肉型平均瘤重在3~5g; 皮下腫瘤平均瘤重為3~12g; 腹水型動物平均生存10~14d。 4.第7d 給藥組動物存活率應(yīng)大于65%, 否則表明所試藥物劑量過大。,90,(三)Lewis肺癌模型(√) 1951年Lewis在未經(jīng)過處理的C57BL小鼠肺發(fā)現(xiàn)了未分化上皮樣腫瘤，此后

45、建立了實體型移植性腫瘤模型。,91,[操作步驟] 1.取C57BL/6小鼠皮下接種8~12d的Lewis肺癌作為瘤源，無菌條件下剝離瘤組織，用剪刀剪成小塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加無菌生理鹽水(1:3)研磨成勻漿，過400目絲網(wǎng)，成單細(xì)胞懸液，計數(shù)每毫升勻漿液中的瘤細(xì)胞數(shù)。,2.給每只成年C57BL/6小鼠腋窩皮下接種2×106個細(xì)胞（0.2ml/只）。,92,3.接種后第1天進(jìn)行動物分組并給藥，陽性對照藥用環(huán)磷

46、酰胺50mg/kg體重(0.2ml/10g體重),隔日灌胃給藥，共給3次。給藥組每天灌胃給予受試藥1次，實驗對照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)10d。,4.末次給藥后24h處死動物，稱體重，剝離腋窩下腫瘤并稱重，計算瘤重生長抑制率。,93,皮下移植Lewis肺癌的C57BL/6小鼠,94,Lewis肺癌移植瘤,95,[模型評價] Lewis肺癌惡性程度較高，受體鼠為C57BL/6小鼠，是目前國際應(yīng)用較普遍的移植腫瘤模型之一，由于其接種部

47、位的不同，用途比較廣泛。本方法是評價藥物體內(nèi)抗腫瘤作用最常用的方法，對藥物作用的預(yù)測性很好。,96,[注意事項] 1.實驗開始和實驗結(jié)束時應(yīng)分別稱量動物體重，如果給藥組動物體重明顯低于實驗對照組（超過15%），判定藥物療效時應(yīng)注意體重降低對腫瘤生長的影響，排除非特異的毒性作用。,2.腫瘤接種后2周，單個鼠瘤重應(yīng)在500 mg以上，否則說明腫瘤生長不良，腫瘤接種失敗。,97,3.對某些效價較低的藥物，如未純化中草藥有效成分或多糖類的

48、篩選，可將瘤細(xì)胞接種于后肢爪墊皮下，接種細(xì)胞數(shù)為(2~4)×105/0.02ml（細(xì)胞數(shù)僅為常規(guī)皮下接種量的1/3），接種后給藥治療，10d后從踝關(guān)節(jié)處切除帶瘤的足稱重，計算瘤重抑制率。若切除帶瘤的足后繼續(xù)給藥，還可觀察受試藥對肺轉(zhuǎn)移的療效。,98,(四)L1210白血病小鼠模型(×) L1210白血病最早是用甲基膽蒽在DBA/2小鼠誘發(fā)的，能在DBA/2小鼠及其雜交一代BDF1和CDF1小鼠體內(nèi)生長。小鼠白

49、血病L1210為腹水型腫瘤，是最常用的移植性腫瘤模型。,將1×105個腹水瘤細(xì)胞接種在DBA/2、BDF1或CDF1小鼠腹腔內(nèi)，接種后24 h開始給藥治療，實驗結(jié)束后比較給藥組與實驗對照組小鼠的平均存活時間，可判斷藥物的療效。,99,[操作方法] 1.取接種于DBA/2小鼠約7d的L1210腹水，用生理鹽水配成瘤細(xì)胞數(shù)為106個/ml的細(xì)胞懸液，接種于BDF1或CDF1小鼠腹腔內(nèi)，每只小鼠接種0.1ml（含瘤細(xì)胞1

50、5;105個）。,100,2.實驗當(dāng)天接種動物，將瘤株進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。接種后第1天檢查培養(yǎng)情況，如無污染，將稱量動物體重并隨機(jī)分組后開始給藥。接種后第2天再檢查培養(yǎng)情況，如有污染，則實驗報廢。,動物分組包括實驗對照組、受試藥組及陽性對照藥，均腹腔注射給藥。給藥方案有多種。第20天如果除陽性對照藥組及受試藥組外再無其他動物存活，則終止實驗，評價結(jié)果。第30天處死全部動物，并評價受試藥的療效。,101,[結(jié)果] 小鼠接種L1210后平均

51、存活8~11d。一般觀察30d，根據(jù)各組動物的平均存活天數(shù)，按公式計算受試藥對L1210白血病小鼠的生命延長率（未死亡動物按30d計）。,102,[注意事項] 1.本方法也適用于P388、EAC、Hep、W256和S180等腹水型移植性腫瘤模型。 2.如瘤株培養(yǎng)證明被污染，需重新接種動物。,3.接種后第5天給藥組動物存活率應(yīng)大于65%，否則說明藥物劑量過大或藥物有毒性。 4.如實驗對照組動物在18d內(nèi)仍未死亡，則認(rèn)為腫

52、瘤生長不良，接種失敗，應(yīng)分析原因重新實驗。,103,(五)小鼠腎包膜下腫瘤移植模型(×) 在裸鼠、BDF1或CDF1小鼠的腎包膜（腎纖維膜）下移植人的瘤細(xì)胞，由于移植的瘤塊僅1mm3，可由腎包膜下豐富的血管供給營養(yǎng)和氧，瘤塊能迅速增長，短期內(nèi)(6~11d)腫瘤生長較規(guī)則，接種成活率接近100%。,104,[操作方法] 小鼠腎包膜下異種移植的腫瘤多選用人癌，其來源于裸鼠皮下接種傳代16~22d的人癌瘤株、人癌培養(yǎng)細(xì)胞

53、株或手術(shù)切除的新鮮癌組織。,105,1.在無菌操作下取小鼠或人體瘤組織，剪去包膜及出血壞死部分，切成約1mm3小塊。選用體重18~22g裸鼠、BDF1或CDF1小鼠，麻醉后手術(shù)區(qū)消毒，打開腹腔暴露左腎，將1小塊瘤組織裝入套管針內(nèi)，移植于腎外側(cè)中線處的包膜下。,106,2.在裝有顯微尺的體視顯微鏡下，測量起始移植塊的長徑(a)和短徑(b)，測量后關(guān)閉腹部切口。如在腎包膜下注射培養(yǎng)的瘤細(xì)胞株，則注射含1×107個細(xì)胞的懸液0.02

54、 ml，不必測量移植瘤塊的長短徑。,107,3.接種次日分組、給藥，每天給藥1次，共5~10d。停藥次日，即BDF1小鼠接種后6d或裸鼠接種后11d，稱量體重，解剖帶瘤腎臟，在體視顯微鏡下測量瘤塊的長徑(a)和短徑(b)，按ab2/2公式計算瘤體積(V)。,4.腫瘤體積(V)也可以用下式計算：V＝(4/3)πabc＝(1/6)πABC，其中π為圓周率，ABC為腫瘤相互垂直的3個直徑，abc為腫瘤相互垂直的3個半徑。,108,109,[結(jié)

55、果計算] 根據(jù)每只鼠的瘤體積計算給藥組瘤體積的相當(dāng)率，表示受試藥對腫瘤生長的抑制作用。如給藥治療后瘤體積較原接種瘤體積減小，表示腫瘤消退，受試藥治療有效，以消退率表示：,110,給藥組平均瘤體積相當(dāng)率（%）= ×100% 實驗對照組平均瘤體積 給藥后平均瘤體積消退率（%）＝ &#

56、215;100% 原接種平均瘤體積,,,111,[注意事項] 1.手術(shù)切除的人體腫瘤需冰凍運(yùn)送，從取出腫瘤到接種應(yīng)在4 h內(nèi)完成。 2.注意無菌操作，瘤源如有污染，應(yīng)終止實驗。 3.瘤塊接種時應(yīng)嚴(yán)格使每只鼠瘤塊的長、短徑控制在0.9~1.2mm。,112,4.應(yīng)嚴(yán)格控制飼養(yǎng)條件和環(huán)境，以免影響動物體重增長而產(chǎn)生非特異性抑瘤作用。 5.若給藥組動物體重下降至原體重的70%、實驗終止時小

57、鼠死亡率超過34%，表示受試藥有毒性，應(yīng)降低劑量重做實驗。,113,114,第六節(jié)抗腫瘤藥物體外研究方法,用體外細(xì)胞作抗癌藥篩選具有用藥量少, 周期短, 費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。體外篩選結(jié)果與體內(nèi)試驗的相關(guān)性好, 因此, 抗癌藥體外篩選已作為常規(guī)的抗癌藥初篩手段。,體外研究方法,然而,體外研究方法也有一定局限性，主要是體內(nèi)環(huán)境極為復(fù)雜，與體外實驗環(huán)境有很大差別，體外篩選的最大缺點(diǎn)是無法獲得藥物對組織選擇性方面的資料。此外, 有些藥物須在體內(nèi)代

58、謝活化 (如環(huán)磷酰胺)或通過機(jī)體反應(yīng)(生物調(diào)節(jié)劑)才能對腫瘤細(xì)胞起作用, 因而不能通過體外篩選尋找。,體外研究方法,目前世界上已建立了很多體外癌細(xì)胞系(株)。藥物篩選應(yīng)選用生長特性穩(wěn)定, 增殖快, 對已知抗癌藥敏感的細(xì)胞系。小鼠與人的細(xì)胞系對藥物的反應(yīng)大致相同, 前者具有在體內(nèi)外均可進(jìn)行試驗的優(yōu)點(diǎn), 故較常應(yīng)用。,體外研究方法,觀察藥物對腫瘤細(xì)胞體外生長的抑制作用，可選擇10~15種以上腫瘤細(xì)胞系(株)進(jìn)行體外研究，受試藥用5個或5個以

59、上不同濃度，觀察藥物對細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活、細(xì)胞膜功能、生長曲線、克隆形成能力等指標(biāo)的影響。每項指標(biāo)各有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此，應(yīng)根據(jù)實際情況將幾項指標(biāo)組合起來應(yīng)用。,體外研究方法,一、體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖特性 細(xì)胞生長是指細(xì)胞體積的增大，細(xì)胞增殖是指細(xì)胞數(shù)目的增多。體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長增殖到一定密度時，則需進(jìn)行傳代(passage)。細(xì)胞每傳一代后，一般要經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)生長期和停滯期3個階段。,體外研究方法,* 在指數(shù)生長期，取

60、細(xì)胞數(shù)的對數(shù)與培養(yǎng)時間作圖，可得一條斜率向上的直線，故也稱此期為對數(shù)生長期，約3~5 d,體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞按其生長方式可分為貼附生長型和懸浮生長型兩大類: 貼附生長型: 細(xì)胞在培養(yǎng)時能貼附在支持物表面生長，有時稱貼壁生長。,體外研究方法,懸浮生長型: 細(xì)胞在體外培養(yǎng)時不需要附著于支持物而在懸浮狀態(tài)下生長，如取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞、血白細(xì)胞等。,二、MTT法 [基本原理] MTT是一種溴化四氮唑, FW:414.

61、3, 是能接受氫原子的染料。MTT可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲臢, 而死細(xì)胞則無此功能。甲臢的生成量通常與活細(xì)胞數(shù)成正比, 在一定波長下用酶標(biāo)儀測定吸光度值(A), 即可定量測出細(xì)胞的存活率。,MTT,[試劑與器材] 1.MTT溶液 用生理鹽水或PBS配制成5 mg/ml貯存液，在磁力攪拌機(jī)上攪拌30min使之完全溶解。用前通過0.22μm濾膜除菌和沉淀物，4℃避光保存

62、，兩周內(nèi)有效。呈黃色,無沉淀。暫時不用，可凍存。 2.含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，不含酚紅指示劑；0.25%胰酶消化液；DMSO原液（分析純）,作為甲臢的溶解液。,MTT,[試劑與器材] 3. 96孔培養(yǎng)板(用新的）,血細(xì)胞計數(shù)板，微量移液器，微型振蕩器，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀。,MTT,[操作步驟] 1.選用對數(shù)生長期的貼附腫瘤細(xì)胞→0.25%胰酶消化→懸浮于含10%胎牛血清的RPMI16

63、40培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)液)→吹打成細(xì)胞懸液。 2.用臺盼藍(lán)拒染法檢測,活細(xì)胞應(yīng)在97%以上。 若是懸浮生長細(xì)胞, 可直接用臺盼藍(lán)排染法計數(shù)活細(xì)胞。,MTT,3.96孔培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞懸液190μl，每孔含5000~40000個細(xì)胞(根據(jù)細(xì)胞的類型而定)。接種后，37℃、5%CO2預(yù)培養(yǎng)24h。 4.將受試藥物配成終濃度的20倍。受試藥可用DMSO、培養(yǎng)液或生理鹽水溶解?？稍O(shè)5~7個濃度組。,MTT,5.加藥組每孔加入1

64、0μl藥液。因接種的細(xì)胞懸液體積為190μl，又加入了10μl藥液，因此藥液被稀釋了20倍，等于所需要的終濃度。每組設(shè)3~5個平行孔，最好5個。 6.細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48h。然后每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。,MTT,7.小心吸棄孔內(nèi)上清液(若為懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，需1000r/min離心5min后再吸棄上清)。每孔加入150μl DMSO，微型振蕩器上振蕩約10min，使甲臢結(jié)晶完全

65、溶解。,MTT,96孔板用離心機(jī),8.設(shè)置對照組 ：空白對照孔(調(diào)零孔)：培養(yǎng)液、MTT和DMSO。 實驗對照組：細(xì)胞、相同濃度溶解藥物的溶劑 + 培養(yǎng)液、MTT和DMSO 加藥組 ：細(xì)胞、受試藥物 + 培養(yǎng)液、MTT和DMSO陽性藥對照組:細(xì)胞、陽性藥 + 培養(yǎng)液、MTT和DMSO （操作步驟同加藥組）,MTT,9.用酶標(biāo)儀在570nm波長測定每孔的A值(

66、參考波長450 nm)。測定時以空白對照孔調(diào)零。應(yīng)盡快完成測定。,MTT,[結(jié)果評定]按下式計算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：  實驗對照組平均A值－加藥組平均A值腫瘤細(xì)胞生長抑制率(%)＝ ×100%

67、 實驗對照組平均A值,,MTT,以同一樣品的不同濃度藥物對腫瘤細(xì)胞生長抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線, 從中求出該樣品的半數(shù)抑制濃度IC50,MTT,[評價] 本方法已廣泛用于抗腫瘤藥物篩選、一些生物活性因子的活性檢測、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。該方法的特點(diǎn)是靈敏度高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)、操作簡便、易實現(xiàn)自動化、無放射性污染，且與其他檢測細(xì)

68、胞存活的方法（如細(xì)胞計數(shù)法、克隆形成試驗和3H-TdR摻入試驗等）有良好相關(guān)性。,MTT,[注意事項] 1.MTT被活細(xì)胞中脫氫酶還原所形成的結(jié)晶產(chǎn)物不溶于水，需加入有機(jī)溶劑溶解后才能測定A值，選擇不同的有機(jī)溶劑或結(jié)晶產(chǎn)物溶解不完全，對結(jié)果有一定影響。,2.酶標(biāo)儀濾光片的選擇 甲臢的吸收峰受一些因素的影響，如溶解甲臢的溶劑、pH等。因此，首先應(yīng)用優(yōu)質(zhì)分光光度計測定實驗對照組的最大吸收峰，在此基礎(chǔ)上選擇合適的濾光片。,MTT,3.細(xì)

69、胞系的選擇及接種的細(xì)胞數(shù) 由于實驗應(yīng)設(shè)計在活細(xì)胞數(shù)與A值呈線性關(guān)系部分進(jìn)行，故應(yīng)選用在4~7d生長速度適合作此項分析的細(xì)胞系。選擇適量接種細(xì)胞數(shù)的原則是，實驗對照組的細(xì)胞在實驗結(jié)束時的A值與活細(xì)胞數(shù)之間仍處于線性范圍（一般A值在0.2~2.0之間）。,4.甲臢的生成不僅與活細(xì)胞數(shù)成正比，也受加入MTT后作用時間的影響，即A值可隨著放置時間而改變。,MTT,5.培養(yǎng)液中的酚紅、人血清蛋白、免疫球蛋白和某些添加劑可使A值增高。在進(jìn)行MTT