液相色譜技術(shù)

1、7 高效液相色譜技術(shù)（HPLC）,高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。其缺點(diǎn)是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機(jī)離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢是向生物化學(xué)和藥物分析及制備型傾斜。 高效液相色譜（HPLC：High Performance Liquid Chromatography

2、 ）是化學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學(xué)科領(lǐng)域與專業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)家、生物化學(xué)家等用以解決他們面臨的各種實(shí)際分離分析課題必不可缺少的工具。國際市場調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。,7.1 基本原理 加樣 流動相 流動相 固定相 流動相

3、 A C B B

4、 C A

5、 固定相 —— 柱內(nèi)填料，流動相 —— 洗脫劑。 HPLC是利用樣品中

6、的溶質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)可以作如下的分類： 分配色譜：—— 分配系數(shù) 親和色譜：—— 親和力 吸附色譜：—— 吸附力 離子交換色譜：—— 離子交換能力 凝膠色譜（體積排阻色譜）：——

7、 分子大小而引起的體積排阻,分配色譜又可分為： 正相色譜：固定相為極性，流動相為非極性。 反相色譜：固定相為非極性，流動相為極性。 用的最多，約占60～70％。固定相（柱填料）： 固定相又分為兩類： ①一類是使用最多的微粒硅膠； ②另一類是使用較少的高分子微球：

8、 優(yōu)點(diǎn)是強(qiáng)度大、化學(xué)惰性、使用pH范圍大 (pH=1～14)； 缺點(diǎn)是柱效較小，常用于離子交換色譜和 凝膠色譜。,最常使用的全孔微粒硅膠（3～10μm）是化學(xué)鍵合相硅膠，這種固定相要占所有柱填料的80％。它是通過化學(xué)反應(yīng)把某種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)官能團(tuán)（例如各種有機(jī)硅烷），鍵

9、合到硅膠表面上，取代了羥基（－OH）而成。它是近代高效液相色譜技術(shù)中最重要的柱填料類型。 使用微粒硅膠要特別注意它的使用pH范圍是 2～7.5，若過堿（＞pH8），硅膠會粉碎或溶解；若過酸（＜pH1），鍵合相的化學(xué)鍵會斷裂。有些特殊的健合相可以用于pH 9～11。 鍵合相使用硅膠作基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是： ①硅膠的強(qiáng)度大；②微粒硅膠的了孔結(jié)構(gòu)和表面積易人為控制；③化學(xué)穩(wěn)定性好。,硅膠 ( SiO2?n H2O) ：

10、 OH OH —Si—O—Si—   ｜ ｜ 重要的鍵合相是：硅烷化鍵合相，它是硅膠與有機(jī)硅烷反應(yīng)的產(chǎn)物

11、。 最常用的鍵合相鍵型是： ｜ ｜ —Si—O—Si—C ｜ ｜ ｜

12、 R1 ｜ R1 —Si—OH + X—Si—R —Si—O—Si—R + HX ｜ R2 ｜ R2

13、 硅膠 有機(jī)硅烷 鍵合相 X ━ Cl，CH3O，C2H5O等。 R ━ 烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1 、R2 ━ X、CH3等。,,,,,,,,最常用的“萬能柱”填料為“C18”，簡稱“ODS”柱，即十

14、八烷基硅烷鍵合硅膠填料（Octadecylsilyl，簡稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70～80％的分析任務(wù)。由于C18(ODS)是長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛，近年來，為適應(yīng)氨基酸、小肽等生物分子的分析任務(wù)，又發(fā)展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（20～40μm）。 按鍵合到基

15、質(zhì)上的官能團(tuán)可分為：⑴反相柱：填料為非極性，官能團(tuán)為烷烴，例如：C18(ODS)、 C8、C4等。 ⑵正相柱：填料為極性，官能團(tuán)為 －CN氰基、－NH2氨基等。⑶離子交換鍵合相： 陽離子官能團(tuán)：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 陰離子官能團(tuán)：―R4N＋季銨基、-氨基等。( 由于硅膠基質(zhì)的鍵合相只能在pH＝2～7.5的范圍內(nèi)使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質(zhì)現(xiàn)在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。

16、),流動相：1. 反相色譜最常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃 最常用的流動相組成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的劇毒性，通常優(yōu)先考慮“甲醇—H2O”流動相。2. 正相色譜常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度的順序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇 最常用的是正已烷，雖然其價格較貴，但80％的順、反和鄰位、對位異構(gòu)體仍

17、然要用正相色譜來進(jìn)行分離。,反相色譜中，溶質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，所以先被洗脫下來。流動相的pH對樣品溶質(zhì)的電離狀態(tài)影響很大，進(jìn)而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質(zhì)等生物大分子的過程中，經(jīng)常要加入修飾性的離子對物質(zhì)，最常用的離子對試劑是三氟乙酸（TFA），使用濃度為0.1％，使流動相的pH值為2～3，這樣可以有效地抑制氨基酸上α羧基的離介，使其疏水性增加，延長洗脫時間，提高分辨率

18、和分離效果。 完全離子化的溶質(zhì)，例如強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，其在反相鍵合相上的保留值很低，近于死時間流出，不能進(jìn)行分析。根據(jù)離子對色譜的原理將一種與樣品離子電荷（A＋）相反的離子（B－），稱為對離子，加入到流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對，即中性締合物，從而增強(qiáng)了樣品的疏水性，加大了保留值，改善了分離效果。,流動相的選擇原則是： ①樣品易溶，且溶解度盡可能大。 ②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子。 ③不妨礙檢測

19、器檢測，紫外波長處無吸收。 ④粘度低，流動性好。 ⑤易于從其中回收樣品。 ⑥無毒或低毒，易于操作。 ⑦易于制成高純度，即色譜純。 ⑧廢液易處理，不污染環(huán)境。,7.2 基本參數(shù) 1.  保留值 進(jìn)樣   t0

20、 tR ⑴保留時間“ tR”：進(jìn)樣至出峰的時間。 ⑵死時間“ t0”：不被柱子吸附的惰性物質(zhì)的出峰時間。 死時間“ t0”的測定通常是使用不被柱子保留而又有紫 外吸收的惰性物質(zhì)，例如：正相色譜常用四氯化碳， 反相色譜常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等。,,,,,,,,,,,,⑶容量因子“ k’ ”：

21、 或： “ k’ ”是比“ tR”還常用的保留值，它與柱子的大小及流速無關(guān)，只與溶質(zhì)在固定相和流動相的分配性質(zhì)、柱溫以及相空間比（即固定相和流動相之體企積比）有關(guān)?！?k’ ”又定義為在分配平衡時某溶質(zhì)在兩相中絕對量之比，消除了保留值的波動因素，而平衡常數(shù)“ K ”是平衡時物質(zhì)在兩相中的濃度比。 k’值的范圍： 0.4＜k’＜20～30 k’＝2～5為佳，過大則耗時太長。,,⑷保留體積：

22、VR＝tR?FC ( FC --- 流動相的流速 mL/min ) VR 是在 tR 時間內(nèi)流動相流過柱子的體積。 調(diào)整保留時間：tR’＝ tR－t0 調(diào)整保留體積：VR’＝ VR－VR0＝tR’ ?FC ⑸選擇性指標(biāo)“α’ ”和相對保留值“α” α’ 可以更直觀和方便地反映色譜峰分離的好壞：

23、 進(jìn)樣 tR(1) tR(2) 相對保留值α(分離因子)： ( α＞1.1為好 ),,,,,,,,2.   柱效率：定義： 理論塔板數(shù) ： ( 每米柱

24、) ?—標(biāo)準(zhǔn)偏差，曲線拐點(diǎn)處峰寬的 1/2h 2? 一半，即峰高0.607處峰寬的一半。   W1/2 為便于測量，改用半峰

25、寬： 1/2h W1/2( 或2×△t1/2 ) Wb 最常用的計(jì)算式： 另一計(jì)算式：

26、 ( Wb不如W1/2容易測量，因而此式用的較少。),,,,,,,,,,,,,,理論塔板高度： ( L — 柱長)經(jīng)驗(yàn)式： H＝2dP ( dP＝10μ H＝20μ N＝5萬 ) ( dP＝5μ

27、 H＝10μ N＝10萬 ) dP—柱填料的顆粒直徑 柱效的測定和計(jì)算： 以反相柱為例，流動相用87％(V/V)的甲醇:水，樣品用苯、聯(lián)苯、萘等，加快記錄儀的走紙速度，測出半峰寬W1/2，并由走紙速度換算為與 tR 相同的單位 “分” 或 “秒” ，代入公式，計(jì)算出柱效N。 提高柱效的方法： ①固定相填料要均一，顆粒細(xì)，裝填均勻。 ②流動相粘度低。

28、 ③低流速。 ④升高柱溫。,,3.   不對稱因子“Tf”： 用于形容色譜峰拖尾和前伸的程度，多數(shù)為拖尾峰。  h 進(jìn)樣 進(jìn)樣 A

29、 B 0.1h 拖尾 前伸 ( A、B如上圖所示)

30、 通常 Tf＝1.2～1.3 ，若 Tf＞2 則峰不合格。 峰拖尾的原因是硅膠基質(zhì)上的Si－OH羥基未被全部鍵合而與溶質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。 改進(jìn)拖尾要用封尾技術(shù)：即用小分子的含甲基的物質(zhì)再次對硅膠進(jìn)行鍵合，封閉硅羥基；還可在流動相中加入帶 –NH2氨基(對羥基敏感)的物質(zhì)，將殘余的羥基掩閉。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,分辨率：

31、 tR(1) tR(2)   進(jìn)樣 W1/2(1)

32、 W1/2(2) tW1 tW2 4. 分離

33、度 K1和 K3 HPLC的目的和要求是：峰要盡可能窄（W1/2小），峰間距大（tR相差大）。 ⑴基線分離度 K1 ： ( 基線分離時用K1。) H h,,,,,,,,,,⑵峰高分離度：

34、 ( K3＝1 基線分離，K3 更反映了實(shí)際分離度。),,,,,,,,,5.  線速度：溶劑在柱中移動的速度。 mm/sec ( L─柱長 t0 ─死時間)

35、 H(μm) 粗

36、粒 如右圖所示，用實(shí)驗(yàn)可找到最佳的線速度： 細(xì)粒 即圖中的A點(diǎn)：u＝1 mm/sec 此處不用流量而用線速度，是因?yàn)榱髁颗c

37、 柱徑有關(guān)，而線速度與柱徑無關(guān)。 請記住不同柱內(nèi)徑的最佳流量： A B u(1mm/sec) 柱內(nèi)徑 流量

38、 線速度 5 mm 1.0 mL/min 1 mm/sec ( B奌： u＝2 mm/sec ) 2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec 1 mm 50 μL/min 1 mm/sec 由 “1 mm/sec ” 最佳線速度可計(jì)算出適合各種柱徑的

39、最佳流量。 由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂貴的乙腈，若用1mm柱，則一個月才用一并。,,,,,,,,,,5.  保留值方程： 正相色譜： lnk’＝a＋blnCb＋cCb 反相色譜： lnk’＝a＋cCb 離子交換色譜： lnk’＝a＋blnCb

40、   ( Cb─強(qiáng)沖洗劑濃度 )  ( 對于不同溶質(zhì) a、b、c 系數(shù)不同 ) ( 反相色譜是線性方程 ) 正相色譜：

41、 反相色譜： lnk’ lnk’   

42、 Cb Cb,,,,,,,lnk’ lnk’

43、 萘 四氫呋喃/水 D 甲醇/水 苯

44、 Cb D Cb (甲醇/水) D點(diǎn)：同樣的容量因子，四氫呋喃 D點(diǎn)：萘非極性強(qiáng)，k’大，斜率陡 用量少  lnk’ 甲 lnk

45、’   乙  C A B Cb A A D A Cb  

46、 A點(diǎn)甲、乙二溶質(zhì)分不開，B點(diǎn)比 A點(diǎn)分不開，要尋找不是交叉點(diǎn)的 C點(diǎn)沖洗劑濃度高，但k’小，省時 D點(diǎn)的Cb濃度為分離條件 間，所以選B點(diǎn)好。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,所以，改變Cb濃度，保留值k’和選擇性α都改變了，尋找最佳的Cb濃度就是HPLC高效液相色譜技術(shù)的精髓所在。