逆流液相色譜副本

1、第二組,大家早上好！,,,,原理特征,逆流色譜法（CCC）：基于樣品在兩種互不混溶的溶劑之間的分配作用，溶質(zhì)中各組分在通過兩溶劑相過程中因分配系數(shù)不同而得以分離。這是一種不用固態(tài)支撐體的全液體色譜方法。,用很長(zhǎng)的軟管繞制成的色譜柱內(nèi)不加入任何固態(tài)支撐體或填料。用此體系的上層或下層作為色譜過程的固定相，首先將其注滿管柱內(nèi)，然后讓此管柱作特定的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，用由此形成的離心力場(chǎng)來支撐住柱內(nèi)的液態(tài)相。,根據(jù)被分離混合物的理化特性.選擇某一種有機(jī)/

2、水兩相溶劑體系或雙水相溶劑體系，此體系可以是二元的或多元的。,若用溶劑體系中的另一層作為流動(dòng)相，帶著混合樣品由泵的壓力推入分離管柱，樣品就會(huì)穿過兩個(gè)液相對(duì)流的整個(gè)管柱空間，各個(gè)組分就會(huì)按其在兩相中的分配系數(shù)分離開來。,液滴逆流色譜(DCCC)旋轉(zhuǎn)小室逆流色譜(RLCC)離心逆流色譜法高速逆流色譜法(HSCCC),逆流類型,DCCC (液滴逆流色譜): 是在逆流分溶法基礎(chǔ)上創(chuàng)建的色譜裝置，可使流動(dòng)相呈液滴形式在固定相間交換，促

3、使溶質(zhì)中各組分在兩相之間進(jìn)行分配，達(dá)到分離效果。,液滴逆流色譜(DCCC),,缺點(diǎn)：流動(dòng)相流速低，每小時(shí)只有十幾毫升；分離過程長(zhǎng)，一般需要幾十小時(shí)才能完成一次幾個(gè)組分的分離．,旋轉(zhuǎn)小室逆流色譜（RLCC）,用中心有一小孔的聚四氟乙烯園盤將分離柱管分隔成若干連通的小空間，再將若干根這樣的柱管排列在圓形轉(zhuǎn)盤架上，柱管之間用聚四氟乙烯管串聯(lián)起來。溶劑通過旋轉(zhuǎn)密封接頭進(jìn)出這組分離柱管。,,柱管以一定的轉(zhuǎn)速和傾角繞轉(zhuǎn)盤中心軸轉(zhuǎn)動(dòng)。流動(dòng)相進(jìn)入第一

4、個(gè)小室后，取代其中原已注滿的固定相的位置，直到流動(dòng)相液面達(dá)到圓盤上小孔的水平時(shí)，流動(dòng)相就會(huì)穿過小孔進(jìn)入下一個(gè)小室，并依次從一根柱管進(jìn)入另一根柱管。隨著流動(dòng)相逐步穿過各個(gè)小室，帶動(dòng)樣品在各個(gè)小室的兩相間分配。,,離心逆流色譜法：儀器工作的時(shí)分離柱要繞中心軸在設(shè)備中高速轉(zhuǎn)動(dòng)，因?yàn)楦咚傩D(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力可使兩相劇烈地反復(fù)混合分層，實(shí)現(xiàn)快速高效的分離。,離心逆流色譜,非行星式逆流色譜儀：主要包括分離柱室螺旋式和非螺旋管式，主要是匣盒式離心逆流色譜

5、儀。 行星式逆流色譜儀：分離柱幾乎全是利用聚四氟乙烯管繞成的螺旋線圈。,高速逆流色譜法（HSCCC）,HSCCC是一種不用任何同態(tài)載體的液．液色譜技術(shù)，其原理是基于組分在旋轉(zhuǎn)螺旋管內(nèi)的相對(duì)移動(dòng)而互不混溶的兩相溶劑間分布不同而獲得分離，其分離效率和速度可以與HPLC相媲美。,高速逆流色譜,,線圈300ml,,,,,高速逆流色譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),,,,1、不用固態(tài)載體的高效液-液分配色譜技術(shù)2、不存在樣品的不可逆吸附，理論回收率100

6、%3、樣品負(fù)載能力強(qiáng)，制備量大，重現(xiàn)性好4、操作成本低，無制備柱消耗，后續(xù)投入較低5、可采用廣泛的溶劑體系和多樣性的操作條件6、操作簡(jiǎn)單，無需太多樣品前處理,,應(yīng)用實(shí)例,例1低速逆流色譜分離制備梔子黃色素中的藏花素,藏花素具有廣譜抗癌活性，對(duì)白血病、卵巢癌、結(jié)腸癌、橫紋肌肉瘤和軟組織肉瘤等都具有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎無毒性,兩相溶劑系統(tǒng)由叔丁基甲基醚-正丁醇-乙腈·水(2：2.5：1：5，v／v／v／v)

7、組成，以上相為固定相．下相為流動(dòng)相。在轉(zhuǎn)速為50 r／min和流速為5mL／mm的條件下，從5 g梔子黃色素粗樣中分離得到2.47 g藏花素，純度為96.8％。,取樣溶解,進(jìn)樣,洗脫,收集,反向洗脫,,,,,正交實(shí)驗(yàn),固定兩相的濃度、組成，研究不同轉(zhuǎn)速、流動(dòng)相流速對(duì)固定相保留率的影響,固定相保留率越高對(duì)分離越有利，因此最佳轉(zhuǎn)速選為50r／min。流動(dòng)相的流速不但影響分離時(shí)間，而且也會(huì)對(duì)分離度產(chǎn)生一定的影響。在其他參數(shù)相同的條件下，流速越

8、大，分離時(shí)間越短，但是固定相保留率越小，分離度就越小。因此流速選擇要盡可能保證固定相保留率和分離度綜合實(shí)際分離情況，本實(shí)驗(yàn)最佳流速選為5 mL／ min。,例2高速逆流色譜純化白藜蘆醇的研究,白藜蘆醇具有多種生物學(xué)活性及藥理作用， 它具有抗癌、抗菌、抗氧化、預(yù)防心臟病、降血脂和抗誘變等作用，特別是具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性及對(duì)心血管系統(tǒng)的作用! 已經(jīng)成為食品及醫(yī)藥行業(yè)研究的熱點(diǎn)。,實(shí)驗(yàn)步驟：虎杖→粉碎→提取→過濾→濃縮→預(yù)處理除雜, 乙醚

9、沉淀→濃縮→分離出大黃素→高速逆流色譜分離→收集相應(yīng)波峰的流出液→干燥→白藜蘆醇成品,虎杖中白藜蘆的提取采用有機(jī)溶劑回流提取和超聲波強(qiáng)化提取法。其中超聲波強(qiáng)化提取法時(shí)間很短，可以大大縮短生產(chǎn)周期，且不需加熱，節(jié)能高效,虎杖的提取液預(yù)處理除雜由表1可以看出乙醚沉淀法效果較好除去了大量雜質(zhì)24.9%,高速逆流色譜分離提純 考察了兩種不同的溶劑系統(tǒng)，包括氯仿：甲醇：水=4:3:2 及乙酸乙酯：乙醇：水=10:1

10、:10 其他條件影響不大。結(jié)果，第二種溶劑系統(tǒng)不能將白藜蘆醇及大黃素等其他雜質(zhì)逐個(gè)分開，效果不好，第一種溶劑系統(tǒng)相對(duì)較好。因此，選擇溶劑體系為氯仿：甲醇：水=4:3:2 分離條件采用轉(zhuǎn)速850r/min, 流速2ml/min,進(jìn)樣量5ml提取液,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm, 保留率31.4%,溶解將分離純化所得出的白藜蘆醇用甲醇溶解，在紫外色譜儀上進(jìn)行掃描，并同標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行對(duì)比，得到的譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖相比基本一致,高效液相

11、色譜測(cè)定經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，利用高速逆流色譜分離純化所得白藜蘆醇得率為0.186% 純度大于96%,得出結(jié)論本實(shí)驗(yàn)最佳工藝條件：白藜蘆醇除雜：乙醚沉淀法溶劑體系：氯仿：甲醇：水=4:3:2轉(zhuǎn)速850r/min流速2ml/min進(jìn)樣量5ml提取液,例3夏天無生物堿的高速逆流色譜分離純化,夏天無具有活血通絡(luò)，行氣止痛的功效，主要用于治療中風(fēng)偏癱、跌撲損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛等.夏天無的主要活性成分為生物堿類化合物，

12、如原阿片堿、比枯枯靈和四氫巴馬亭等。建立主要活性成分的分離制備方法，對(duì)夏天無藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制十分必要。,樣品的制備,夏天無3.0 kg,粉碎過篩,加乙醇，回流,過濾,合并濾液,減壓回收乙醇得浸膏,用800 mL l％HCl超聲溶解,過濾,石油醚萃取脫脂,脫脂水溶液加稀氨水?dāng)嚢枵{(diào)節(jié)pH 9.5,沉淀,過濾,得夏天無總生物堿21.3 g，冷藏保存?zhèn)溆?,,,,,,,,兩相溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備,正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:2

13、:8,V/V)，分液漏斗分液,上相加5mmol／L三乙胺作固定相,下相加5 mmol／L HCI作流動(dòng)相,常規(guī)HSCCC二次分離溶劑系統(tǒng)為正己烷一乙酸乙酯一甲醇-水(1：0.8：1.1：1，V／V)，按比例置于分液漏斗中，充分振蕩，靜止分層，分取上下相。樣品用上相和下相各5 mL溶解。,,,,,加堿,3.0g夏天無總生物堿，超聲振蕩溶解,分離及鑒定HSCCC分離過程固定相以9 mL／min流速注滿高速逆流色譜儀的螺旋管，轉(zhuǎn)速為800

14、r／min,樣品注入進(jìn)樣圈(常規(guī)HSCCC二次分離過程需溶劑系統(tǒng)平衡后進(jìn)樣)，同時(shí)流動(dòng)相以2 mL／min流速泵入。開啟檢測(cè)器和記錄儀，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，根據(jù)色譜圖收集各色譜峰組分。HPLC分析及結(jié)構(gòu)鑒定夏天無生物總堿和高速逆流色譜分離各組分用HPLC分析。WatersC18色譜柱,檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流動(dòng)相為乙腈-乙酸／乙酸鈉緩沖溶液(70：30，V／V，pH 5.0)，流速1.0mL／min，進(jìn)樣量10μL。,溶劑的選

15、擇,正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系下相加10 mmol／L濃HCl為溶劑系統(tǒng)，雖然出現(xiàn)平臺(tái)峰，但樣品的分離效果不佳；采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(5:5:2:8，v/v)上相加10 mmol／L三乙胺，下相加10 mmol／L濃HCl為溶劑系統(tǒng)，分離效果明顯改善。但通過HPLC分析，分離效果仍不理想,用降低保留酸堿濃度的方法，取得了較為滿意的分離效果(如圖)。取夏天無生物堿3.0g，采用溶劑系統(tǒng)正己烷·乙酸乙酯-甲醇-水(5

16、:5:2:8,V／V)，上相加5 mmol／L三乙胺，下相加5 mmol／L濃HCl)進(jìn)行分離.在358～484min得到的3比枯枯靈和化合物4四氫巴馬亭的組成的混合物762 mg.,結(jié)論：溶劑系統(tǒng)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:0.8:1.1:1v／v)的分配系數(shù)大小適合分離,例4高速逆流色譜分離純化防風(fēng)中升麻素苷和5-D-甲基維斯阿米醇苷,防風(fēng)為傘形科防風(fēng)屬多年生草本植物,用于治療感冒頭疼、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢和破傷風(fēng)等。2005

17、年版《中華人民共和國(guó)藥典》中，將升麻素苷和5-D-甲基維斯阿米醇苷作為防風(fēng)的指標(biāo)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，升麻素苷和5-D-甲基維斯阿米醇苷具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血小板聚集等多種功效悼'3 J。因此建立相關(guān)成分的高效分離純化方法具有重要意義。,樣品的制備 防風(fēng)根經(jīng)45℃烘干至恒重粉碎，過0.9mm孔徑篩。取100 g防風(fēng)粉末用500 mL甲醇室溫浸提過夜(12 h)，過濾，重復(fù)用400 mL甲醇提取濾渣2次(每次8

18、 h)，合并提取液，減壓蒸餾，得浸膏5.2g，放置冰箱內(nèi)備用。,分配系數(shù)的測(cè)定 取2 mg粗提物于5 mL試管中，分別加入預(yù)先達(dá)到分配平衡的兩相溶劑系統(tǒng)上、下相各2 mL，劇烈震蕩l min后靜置分層，分別取上、下相用HPLC檢測(cè)，上相峰面積為A1，下相峰面積為A2，分配系數(shù)K=A1／A2。,兩相溶劑系統(tǒng)及樣品溶液的制備 在分液漏斗中配制y(乙酸乙酯)：V(正丁醇)：V(水)=2:7:9兩相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后

19、靜止過夜。上相為固定相，下相為流動(dòng)相，使用前分別用超聲波脫氣30 min。取316 mg防風(fēng)粗提物，溶于12 mL的上／下相(1:1，V／V)混合溶劑系統(tǒng)中，震蕩使之完全溶解，備HSCCC進(jìn)樣。,HSCCC分離過程 用最大流速將上相泵入并充滿分離螺線管→循環(huán)水浴并將溫度設(shè)定為30 ℃→開啟檢測(cè)器并按選定的轉(zhuǎn)速啟動(dòng)主機(jī)→待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處的流出物經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)并由色譜工作站記

20、錄，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分并經(jīng)HPLC檢測(cè)純度。,HPLC色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm i.d,5 pm)；流動(dòng)相：甲醇-水；梯度洗脫，0—10 min，30％一45％甲醇；10—15 min，45％一65％甲醇；15～25 rain，65％一100％甲醇;柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速1.0 mL／min；進(jìn)樣量20μL。,實(shí)驗(yàn)步驟,討論溶劑系統(tǒng)的選

21、擇,不同的溶劑系統(tǒng)具有不同的上、下相之比,粘度、極性、密度等性質(zhì)差異均對(duì)相同的成分產(chǎn)生不同的溶解、分配能力,形成分配系數(shù)的差異,對(duì)分離效果產(chǎn)生一定的影響,結(jié)論：選擇乙酸乙酯-正丁醇-水2:7:9系統(tǒng)做溶劑,結(jié)論與展望,逆流色譜技術(shù)操作簡(jiǎn)單易行，無需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜處理，可在線檢測(cè)出峰；可以和靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，比如與質(zhì)譜、電子電離質(zhì)譜、化學(xué)電離質(zhì)譜、快速原子轟擊質(zhì)譜、熱噴霧質(zhì)譜等的聯(lián)用；應(yīng)用廣泛、無需固體載體，產(chǎn)品純度高等優(yōu)點(diǎn)。不足

22、的是消耗溶劑過多，檢測(cè)限低，靈敏度較差。盡管如此，隨著液相色譜的迅猛發(fā)展，HSCCC將不斷創(chuàng)新，日臻完善。,參考文獻(xiàn),[1]戴德舜,王義明,羅國(guó)安,等.高速逆流色譜進(jìn)展[J].分析化學(xué)評(píng)述與進(jìn)展,2001,29(5):586-591[2]劉迪,陳雪峰,宋曉宇,等.高速逆流色譜技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀[J].食品與機(jī)械,2006,22(2):[3]黃秋霞,周如意,國(guó)大亮,則玉璇.高速逆流色譜法及其在藥物純化領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].齊魯藥事,2010,

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