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文檔簡介
1、馬兜鈴酸類物質,包括馬兜鈴酸(aristolochic acids,AAs)和馬兜鈴內酰胺(aristolactams,ALs),已經被證實具有腎毒性、致癌和致基因突變作用,含馬兜鈴酸類物質的藥用植物和制劑因此被多數(shù)國家禁用。我國也先后取消了關木通、廣防己和青木香的藥用標準,并對含馬兜鈴、尋骨風、天仙藤和朱砂蓮的中藥制劑嚴格按處方藥管理。但是,仍有一些馬兜鈴酸類物質含量較低的中藥或植物藥在使用。因此,為保證用藥安全,應該加強藥品生產、流
2、通和使用各環(huán)節(jié)的監(jiān)管。 中醫(yī)對中藥毒性的認識由來已久,在長期的實踐中,中醫(yī)藥發(fā)展和形成了一系列減毒增效的理論和技術。已經有研究證實,炮制和配伍能夠降低關木通和廣防己等中藥的毒性。我們應該正確認識馬兜鈴酸類物質的毒性作用,在中醫(yī)藥理論指導下,積極開展含馬兜鈴酸類物質中草藥的實驗研究,尋找減毒制毒的規(guī)律和途徑,發(fā)揮其正常的藥用療效,減輕“馬兜鈴酸事件”所帶來的負面影響。本文首先介紹了藥用植物及其制劑中馬兜鈴酸類物質的一系列液相色譜聯(lián)
3、用檢測技術。然后,基于所開發(fā)的色譜檢測平臺,我們對馬兜鈴酸Ⅰ的細胞毒性、細胞毒代動力學進行了初步探討,并建立了關木通配伍過程的成分分析方法,以此從化學角度來研究配伍減毒的物質基礎。 具體研究工作如下: 1.為滿足藥用植物及其制劑中馬兜鈴酸類物質的篩查需求,我們開發(fā)了一個面向最普及的儀器設備和簡單的分析環(huán)境的高效液相色譜方法。通過對提取、分離和分析條件的優(yōu)化,我們成功地對12種藥用植物和兩種制劑中的9個馬兜鈴酸類物質進行了
4、同時分析。該法以甲醇—0.2%HAc為流動相進行梯度洗脫,各種馬兜鈴酸類物質獲得了良好的色譜分離。分析方法的線性范圍約為2個數(shù)量級,在所研究的濃度范圍內,線性相關系數(shù)超過0.9950。日內精密度和日間精密度實驗的相對標準偏差小于4.35%。平均回收率落在88.4—98.8%之間。這些結果表明本法準確可靠。相比于先前的文獻方法,本實驗提出的多組分分析方法在對可疑藥品中的馬兜鈴酸類物質的篩查和定量分析上具有明顯的優(yōu)勢,更有效,更實用。
5、 2.馬兜鈴酸類物質是弱極性的小分子化合物,在電噴霧質譜(electro—sprayionization/mass spectrometry,ESI/MS)中的離子化效率不高,易受離子抑制效應的影響。通過對基質效應、離子化模式和錐孔電壓的影響等因素的研究,我們系統(tǒng)探討了馬兜鈴酸類物質在ESI質譜中的離子化行為,找到了它們的ESI質譜裂解規(guī)律,第一次系統(tǒng)闡述了各種馬兜鈴酸類物質的離子化機理。在此基礎上,通過對實驗條件和儀器參數(shù)的優(yōu)化,降
6、低了離子抑制效應,獲得了比文獻稍高的檢測靈敏度。所開發(fā)的HPLC—DAD—ESI/MS方法可以同時得到每個色譜峰的保留時間、紫外光譜圖、相對分子量和質譜特征碎片,因而擁有良好的定性能力。我們將該方法應用于9種馬兜鈴科植物和兩個制劑中9個馬兜鈴酸類物質的同時分析,結果令人滿意。 3.為進一步提高馬兜鈴酸類物質的分析靈敏度,我們引入了熒光檢測。根據兩大類馬兜鈴酸類物質(AAs和ALs)的紫外、熒光特性和它們在馬兜鈴科植物中的分布特征
7、(相對高含量的AAs和痕量的ALs),我們將DAD和FLD(fluorescence detection,F(xiàn)LD)串聯(lián)使用,巧妙地實現(xiàn)了對多數(shù)樣品中AAs和ALs的直接分析。當分析痕量的AAs時,我們提出了一個簡單的衍生方法,即在酸性條件下,將AAs的硝基還原成亞氨基而變成相應的ALs再進行分析,因而也實現(xiàn)了對AAs的高靈敏分析。對不同樣品的分析結果表明,DAD和FLD這兩種廉價和普及度廣的檢測器的聯(lián)用與馬兜鈴酸類物質在自然界的分布的結
8、合近于完美。我們將這種HPLC—DAD—FLD聯(lián)用技術應用于各種馬兜鈴科植物及其制劑的分析,結果表明本法選擇性好,靈敏度高。一般情況下,該法的線性范圍可達3—4個數(shù)量級,且線性相關系數(shù)(r2)大于0.9970;檢測限可低至0.2 ng/ml;日內精密度和日間精密度良好,其RSDs小于5.74%:馬兜鈴酸類物質的平均回收率為94.5—99.2%。 4.盡管馬兜鈴酸類物質的腎毒性已經研究得比較深入,但其毒代動力學方面的數(shù)據仍很有限。
9、要獲取AA類物質的毒理學或藥理學數(shù)據,開發(fā)一個能對生物樣品中AA類物質及其代謝產物進行專一靈敏檢測的分析方法,無疑是很有意義的。馬兜鈴酸(AAs)在生物體內的代謝產物主要是相應的馬兜鈴內酰胺(ALs)衍生物。本文首次采用HPLC—DAD—FLD聯(lián)用檢測技術對細胞環(huán)境中的AA I及其代謝產物同時進行了靈敏專屬的檢測。本法的線性范圍可達3個數(shù)量級,且線性相關系數(shù)大于0.9994。各種細胞樣品的分析結果表明了本法具有合適的精密度和靈敏度,適用
10、于細胞毒代動力學的研究?;诘怪孟嗖铒@微鏡和MTT分析,我們研究了AA I對人正常肝細胞L—02的細胞毒性。同時,對細胞培養(yǎng)液中的AA I及其代謝產物進行了色譜分析。實驗檢測到了兩種代謝產物,一種為AL I,另一種也可歸屬為馬兜鈴內酰胺衍生物。依據細胞培養(yǎng)液中的AA I及其代謝產物的濃度-時間數(shù)據,進行了AAI毒代動力學參數(shù)的初步統(tǒng)計估測。 5.研究人員已經通過動物實驗證實了復方配伍能夠降低關木通毒性的事實。為了能從化學角度研究
11、關木通配伍過程毒性成分或活性成分的變化情況,我們開發(fā)了一個具有良好定性定量能力的HPLC—DAD—ESI/MS分析方法。我們對關木通和黃連中的27個組分進行了追蹤分析,并對其中7個主要成分進行了定量分析。關木通配伍黃連后,黃連中的原小蘗堿型生物堿的煎出量明顯減少,但關木通中的馬兜鈴酸類物質仍然不可忽略。關木通配伍大黃的實驗得到了類似結論。實驗中,我們也發(fā)現(xiàn)水煎煮能夠明顯降低關木通中馬兜鈴酸類物質的溶出率,同70%乙醇提取方法相比,水回流
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