肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷馬小玲

1、1,結(jié)核分枝桿菌的試驗(yàn)室診斷,安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科 馬筱玲,2,結(jié)核疫情及診斷進(jìn)展,3,黛玉臉色蒼白， 瘦骨嶙峋，經(jīng)不斷咳嗽及吐血后，香消玉殞，結(jié)束了一場(chǎng)哀怨凄絕的愛情故事。,4,我國結(jié)核病疫情,全球結(jié)核病第二高負(fù)擔(dān)國家，結(jié)核病疫情表現(xiàn)有“六多” 。一、感染人數(shù)多——5.5億人感染過結(jié)核菌，約占全國人口 的45％，高于全球平均水平。二、患病人數(shù)多——活動(dòng)性肺結(jié)核、

2、傳染性肺結(jié)核患病率 分別為367/10萬和122/10萬，三、新發(fā)患者多——全國每年新發(fā)活動(dòng)性肺結(jié)核患者145 萬， 其中傳染性 肺結(jié)核患者65萬。 四、死亡人數(shù)多——全國每年約有13萬人死于結(jié)核病。五、農(nóng)村患者多——全國約有80％的結(jié)核病人集中在農(nóng)村，

3、 主要在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)的中西部地 區(qū)。六、耐藥患者多——全國結(jié)核病耐藥率高達(dá)28％。,5,結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法介紹,6,概 述,結(jié)核病人的細(xì)菌學(xué)檢查不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，也是結(jié)核病確診和制訂抗癆方案，考核療效、評(píng)價(jià)治療效果的可靠標(biāo)準(zhǔn)。由于結(jié)核菌的遺傳特性決定其生長周期長，致使常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查方法存在著靈敏度低、操作復(fù)雜，需時(shí)間較長和影響因素較多，不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺陷，使細(xì)菌學(xué)診斷發(fā)展緩慢，無法充分滿足

4、臨床診斷的需要。,7,實(shí)驗(yàn)室診斷方法,病原學(xué)診斷輔助診斷,8,病原學(xué)診斷,一、涂片抗酸染色鏡檢法，二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗(yàn)三、熒光染色法四、培養(yǎng)法 五、液體培養(yǎng)＋顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn)六、快速培養(yǎng)檢測(cè)法，七、色譜法 八、分子生物學(xué)法 九、噬菌體生物擴(kuò)增法,9,一、涂片抗酸染色鏡檢法：,國內(nèi)大多采用厚涂片，比薄涂片法可提高陽性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存較久，可備復(fù)查；因費(fèi)時(shí)、繁瑣，綜合醫(yī)療單位常因重視不夠，致涂陽檢出率

5、低于5%，專業(yè)機(jī)構(gòu)涂陽率可達(dá)到30%。國外痰涂片陽性率可達(dá)30%～40%，反復(fù)多次查，可增加到65%～75%；,10,涂片優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉,,11,涂片的缺點(diǎn),敏感性低：5000～10000條菌／ml特異性差：所有分枝桿菌均可著色無法區(qū)別死菌與活菌：結(jié)果均為陽性,12,痰菌假陰性原因,病變是封閉或開放；病變性質(zhì)和其中能夠排出的菌量和排出時(shí)間間歇；結(jié)核分枝桿菌形態(tài)多樣性；,13,二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗(yàn)工作原理,將經(jīng)過消

6、化滅活處理液處理的痰液、或其他體液標(biāo)本混懸液置于具有符合光學(xué)要求基片的夾層杯中，經(jīng)過專業(yè)離心機(jī)離心將混懸液中細(xì)菌或細(xì)胞牢固附著基片上，并在夾層杯中直接染色后取出基片在載波片上封片，置顯微鏡下觀察。,14,優(yōu)點(diǎn)：1、操作方便，易于掌握。2、片中結(jié)核菌分布均勻，染色效果清晰3、液基結(jié)核菌制片技術(shù)較離心濃縮集菌法有顯著提高： 該方法將所有消化后標(biāo)本的抗酸桿菌均完整地保留于液基薄片中，從而顯著提高了檢出率。4、安全性有所提高： 消化，制

7、片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人員不直接接觸標(biāo)本。 采用結(jié)核專用消化液，可有效殺滅結(jié)核分支桿菌，更好的提高了操作的安全性。,15,三、熒光染色法：,是涂片法中陽性率較高，較快速的方法，集菌與熒光染色相結(jié)合，則熒光顯微鏡下的抗酸桿菌陽性率可達(dá)50%，熒光法的缺點(diǎn)： 假陽性率較高， 保存時(shí)間短，不到4個(gè)月,16,四、培養(yǎng)法,一般都用改良羅氏固體培養(yǎng)基接種后第3第7天觀察，以后每周觀察一次菌落生

8、長情況，第8周若仍無生長，報(bào)告為陰性。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確，靈敏度略高于涂片法；可以鑒定死菌與活菌；可進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn).缺點(diǎn)：診斷周期長，最快也需要6周。有一定的污染率,17,,18,培養(yǎng)假陰性的原因,個(gè)別細(xì)菌營養(yǎng)要求的特異性； 細(xì)菌和細(xì)菌營養(yǎng)代謝異質(zhì)性； 細(xì)菌培養(yǎng)前處理對(duì)細(xì)菌活性影響；,19,分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn),絕對(duì)濃度法檢測(cè)分枝桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)是采用含藥羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行的。常用藥物終濃度（μg/ml） ____表

9、1 絕對(duì)濃度法含藥培養(yǎng)基中的藥物終濃度_____ 藥 物 濃 度（μg/ml） 低濃度 高濃度 異煙肼 　 1μg/ml　　 10μg/ml利福平　　　　 1μg/ml　 10μg/ml鏈霉素　　　　10μg/ml　 100μg/ml乙胺丁醇　　

10、 5μg/ml　 50μg/ml 對(duì)氨基水楊酸 1μg/ml　　 10μg/ml 氨硫脲 10μg/ml　 100μg/ml 乙硫異煙胺 25μg/ml　 100μg/ml 卡那霉素 10μg/ml　 100μg/ml卷曲霉素 10μg/ml　 100μg/ml 紫霉素

11、 10μg/ml　 100μg/ml 氧氟沙星 5μg/ml　 50μg/ml左氧氟沙星 5μg/ml　 50μg/ml環(huán)丙沙星 5μg/ml　 50μg/ml司帕沙星 5μg/ml　 50μg/ml力克肺疾 1μg/ml　　 10μg/ml丁胺卡那 10μg/ml　

12、 100μg/ml,20,檢測(cè)方法,1．菌懸液的制備 2.接種及培養(yǎng)3.結(jié)果判定與報(bào)告 敏感（一）： 含藥培養(yǎng)基上無菌落生長。 報(bào)告菌落數(shù)：當(dāng)含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)在20個(gè)以下時(shí)，報(bào)告菌落個(gè)數(shù)。耐藥（1+）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積1/4；耐藥（2+）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積1/2；耐藥（3+）： 含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積3/4；耐藥 (4+)： 含藥培養(yǎng)基上菌落呈菌苔樣生長。,21,本法弊端,操作繁

13、瑣需時(shí)久，4周結(jié)果準(zhǔn)確性差,22,五、液體培養(yǎng)＋顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn),是2000年建立的一種痰標(biāo)本液體培養(yǎng)結(jié)合顯微鏡觀察技術(shù)。其原理是MTB含有索狀因子，因此其在液體培養(yǎng)基中生長時(shí)分泌索狀因子，形成索狀特征性結(jié)構(gòu)，利用倒置顯微鏡觀察索狀結(jié)構(gòu)可用于MTB的快速診斷。由于液體培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此MTB生長迅速，使MTB的培養(yǎng)時(shí)間顯著縮短，培養(yǎng)陽性率顯著增加。該法還能在培養(yǎng)的同時(shí)直接進(jìn)行臨床標(biāo)本的直接藥敏試驗(yàn)，因此能顯著縮短從臨床標(biāo)本到耐

14、藥性測(cè)定的所需時(shí)間，這是其它傳統(tǒng)方法所不具有的，也是MODS的最大優(yōu)點(diǎn)。,23,液體培養(yǎng) +顯微鏡觀察,24,結(jié) 論,本試劑檢測(cè)簡(jiǎn)便，快速，3天就可獲得多耐藥結(jié)核桿菌的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)具有較高的敏感性和特異性，與常規(guī)方法符合率較高，可用于多耐藥結(jié)核病的快速檢測(cè)。痰標(biāo)本直接藥敏試驗(yàn)比常規(guī)方法提早6～8周，更具有快速診斷價(jià)值。本試劑費(fèi)用低廉，不需特殊儀器設(shè)備，適合基層推廣應(yīng)用。本法安全、對(duì)預(yù)防耐藥結(jié)核病的流行與傳播、防

15、止實(shí)驗(yàn)室工作人員的感染具有重要意義。,25,六、快速培養(yǎng)檢測(cè)法,1. BD BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)2. BacT ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng),26,1. BD BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)系統(tǒng),基本原理 培養(yǎng)瓶底部含有包被于樹脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當(dāng)分支桿菌生長使氧消耗后，熒光顯示劑被激活，而發(fā)出熒光。檢測(cè)儀測(cè)試熒光強(qiáng)度，并判定結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：快速 7-14天培養(yǎng)陽性

16、簡(jiǎn)便 比常規(guī)法操作簡(jiǎn)便， 培養(yǎng)陽性率高于L-J法 缺點(diǎn)：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于L-J法，產(chǎn)品依賴進(jìn)口，價(jià)格較貴,27,2．BacT ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng),原理：該系統(tǒng)采用產(chǎn)色檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)中分支桿菌生長情況。因其所用的培養(yǎng)瓶底部有顏色感應(yīng)器，當(dāng)培養(yǎng)瓶中有細(xì)菌生長，C02產(chǎn)生、pH下降時(shí)，顏色感應(yīng)器由綠色變成黃色。儀器自動(dòng)連續(xù)檢測(cè)，檢測(cè)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果自動(dòng)顯示培養(yǎng)瓶中有無分支桿菌生長。優(yōu)點(diǎn)：快速

17、7-14天培養(yǎng)陽性 簡(jiǎn)便 比常規(guī)法操作簡(jiǎn)便， 培養(yǎng)陽性率高于L-J法 缺點(diǎn)：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于L-J法， 　 產(chǎn)品依賴進(jìn)口，價(jià)格較貴。,28,七、色譜法,分為氣相色譜(GC)、氣液相色譜、高效液相色譜(HPLC)等GC等能檢測(cè)分枝桿菌代謝過程中的揮發(fā)性物質(zhì)如脂肪酸所產(chǎn)生的CO2含量，出現(xiàn)不同的色譜峰，從而可鑒定結(jié)核桿菌和大部分NTM菌種，且可測(cè)藥敏。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快

18、速、定量、重復(fù)性好，GC與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用更好；缺點(diǎn)：儀器昂貴，維護(hù)不易，無法普及。,29,八、分子生物學(xué)法,利用分子生物學(xué)檢測(cè)方法來檢測(cè)結(jié)核桿菌特異性基因片斷，從而為結(jié)核病的快速診斷提供依據(jù)。1、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：2、核酸探針(DNA-probe)3、染色體核酸指紋法：4、16s～23srDNA(rRNA)序列法5、耐藥基因的檢則：6、其它分子生物學(xué)方法,30,1、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：,PCR能快速擴(kuò)增結(jié)核分枝

19、桿菌DNA，PCR檢測(cè)假陽性和假陰性問題是影響其應(yīng)用的關(guān)鍵問題。對(duì)于存在的問題對(duì)策如下：擴(kuò)增產(chǎn)物特異性鑒定－探針雜交高質(zhì)量試劑（建立國家級(jí)檢定考評(píng)）規(guī)范化操作（培訓(xùn)操作人員）質(zhì)量控制 （標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室）,31,2、核酸探針(DNA-probe),DNA探針是一小段帶標(biāo)記而能識(shí)別特異性核苷酸序列的單鏈分子。,3、染色體核酸指紋法：,有多種方法，如限制性內(nèi)切酶圖譜(REA)和限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)分析等，RFLP

20、用于菌株菌種鑒定和流行病學(xué)調(diào)查研究。,32,4、16s～23srDNA(rRNA)序列法,用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌都可鑒定出來。,5、耐藥基因的檢則：,已查出的結(jié)核桿菌耐藥基因有rpoB(對(duì)利福平)，Kat、inhA、ahpC(對(duì)異煙肼)，embl(對(duì)乙胺丁醇)，rpsL、rrs(對(duì)鏈霉素)，pncA(對(duì)吡嗪酰胺)和gyrA(對(duì)氟喹諾酮類，gyrB則為低度耐藥)等。,33,九、噬菌體生物擴(kuò)增法（PhaB）,該法19

21、97建立，并用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定。近年來進(jìn)展很快。,34,檢測(cè)原理,分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，并在菌體內(nèi)增殖，裂解菌體，釋放出的子代噬菌體，即可感染隨后加入的指示細(xì)胞（也是一種分枝桿菌），并使指示細(xì)胞裂解，在培養(yǎng)皿上出現(xiàn)噬菌斑。 若先將待檢菌株與某種藥物作用一段時(shí)間后在加噬菌體檢測(cè)，并以不加藥管為對(duì)照，根據(jù)含藥管和不含藥管出現(xiàn)的噬菌斑情況即可判斷細(xì)菌的耐藥性。,35,噬菌體,－病毒,,只能在活的易感細(xì)胞內(nèi)生長

22、溶原性感染和溶菌性感染,36,M.tuberculosis cell,特異性噬菌體識(shí)別MTB,并與之結(jié)合,37,,,,噬菌體DNA進(jìn)入MTB細(xì)胞,并在其內(nèi)擴(kuò)增;同時(shí)生產(chǎn)蛋白外殼,開始產(chǎn)生新的病毒顆粒,DNA,38,,,,,添加特異性殺病毒劑去除所有MTB胞外的噬菌體,胞內(nèi)噬菌體不受損傷。,39,終止殺病毒反應(yīng)，添加非致病性，快生長分枝桿菌（敏感細(xì)胞）,40,結(jié)核分枝桿菌破裂，釋放噬菌體。,41,,MTB細(xì)胞周圍的敏感細(xì)胞，并在其胞內(nèi)增

23、殖,42,經(jīng)過多個(gè)“感染—增殖—細(xì)胞消融”循環(huán)，在瓊脂培養(yǎng)基中的菌苔上形成肉眼可見，清晰的噬菌斑,43,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,44,殺病毒劑殺滅未感染MTB的噬菌體,,MTB裂解, 釋放出來的噬菌體感染敏感細(xì)胞,,,噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌,產(chǎn)生噬菌斑,先以特異性噬菌體感染、裂解標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，再用殺病毒劑清除所有未感染MTB的噬菌體，而結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)的噬菌體繼續(xù)擴(kuò)增，進(jìn)而裂解細(xì)胞，釋放噬菌體。裂解釋放的噬

24、菌體感染隨即添加的敏感細(xì)胞，在其胞內(nèi)擴(kuò)增并裂解敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上肉眼可見的噬菌斑。如待檢標(biāo)本不含結(jié)核分枝桿菌，噬菌體被殺病毒劑完全清除，故無噬菌體感染敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上無噬菌斑出現(xiàn)。,45,,,,,質(zhì)控 陽性對(duì)照 ≥20個(gè)噬菌斑 陰性對(duì)照 ≤10個(gè)噬菌斑,結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn),,標(biāo)本 陽性結(jié)果 ≥20個(gè)噬菌斑 陰性結(jié)果 ≤19個(gè)噬菌斑,陰性：無噬

25、菌斑,陽性：可數(shù)噬菌斑,陽性：噬菌斑部分融合,陽性：噬菌斑完全融合,46,適用范圍,可檢測(cè)痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標(biāo)本用于結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)診斷抗癆治療效果的評(píng)價(jià)※尤其是初診病人的鑒別診斷※用于結(jié)核菌耐藥性的快速檢測(cè)用于HIV高危人群的鑒別診斷,From England !,47,藥敏試驗(yàn),48,,,室溫5分鐘,37℃ 1小時(shí),18-24小時(shí),加入殺毒劑,加入培養(yǎng)基和指示細(xì)胞,藥物＋細(xì)菌,↓,24-48小時(shí),加

26、入噬菌體,MTB,MTB,49,RFP 敏感株結(jié)果,,,,,無 RIF,含RIF,,,50,RFP耐藥株結(jié)果,,,,,無 RIF,含 RIF,,,51,上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室,方法評(píng)價(jià)－優(yōu)點(diǎn),快速：24～48小時(shí)比較靈敏：200～300條/ml檢測(cè)活菌：相對(duì)定量：安全：,52,上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室,方法評(píng)價(jià)－缺點(diǎn),操作步驟多影響因素多有假陽性和

27、假陰性,假陰性率10～88％假陽性率2～48％,53,上 海 市 結(jié) 核 （肺） 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室,假陽性和假陰性原因,噬菌體的交叉感染 －6種NTM檢測(cè)結(jié)果陽性 （偶然、胞內(nèi)、金色、丁酸、恥垢、草分枝）操作因素對(duì)結(jié)果的影響,54,輔助診斷,一、免疫學(xué)診斷方法二、血清學(xué)診斷三、酶學(xué)診斷,55,一、免疫學(xué)診斷方法,PPD皮試，用于鑒別診斷有參考意義。T細(xì)胞亞群和一些細(xì)胞因子：CD3、CD4/CD8

28、、IL-2(R)、干擾素、腫瘤壞死因子等檢查，以了解細(xì)胞免疫狀態(tài)，或作為考核指標(biāo)前后對(duì)比。,56,二.血清學(xué)診斷－結(jié)核抗體檢測(cè),(1)結(jié)明試驗(yàn)(MycoDot)，分枝桿菌細(xì)胞壁富含脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，為一種抗原，能誘發(fā)宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體，激發(fā)遲發(fā)超敏反應(yīng)，不提供保護(hù)性免疫。LAM-IgG有試劑盒供應(yīng)，操作方便，敏感性70%左右，特異性90%左右，適用于菌陰肺結(jié)核病和肺外結(jié)核??；菌陰肺結(jié)核病如果證明試驗(yàn)陽性，示有活動(dòng)性，可給予化療。

29、本法20分鐘可出結(jié)果。(2)金免疫斑點(diǎn)滲濾試驗(yàn)(DIGFA，金標(biāo)法)，用H37Rv PPD-IgG作為抗原，產(chǎn)生與LAM-IgG同樣結(jié)果，國產(chǎn)、價(jià)格較廉。(3)38 KD蛋白質(zhì)抗原，是主要免疫原，用以區(qū)別結(jié)核感染還是NTM感染，正在研究中。,57,測(cè)定方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA）免疫層析試驗(yàn)（DICA）,58,假陽性率15～90％ 假陰性率5～65％,59,結(jié)核抗體檢測(cè)臨床應(yīng)用,

30、1）輔助診斷結(jié)核病2）作鑒別診斷3）用于療效觀察4）在結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用5）作為器官移植并發(fā)結(jié)核感染的監(jiān)測(cè)指標(biāo),60,結(jié)核抗體檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：,簡(jiǎn)便、快速 3-15分鐘 靈敏 陽性率60-95% 特異 特異性80-95% 應(yīng)用面廣 各部位結(jié)核,61,有一定的假陽性和假陰性結(jié)果判斷帶有主觀性缺乏有效的質(zhì)控手段,存在的問題:,62,（二）噬菌體