菌種保藏和使用技術(shù)

1、菌種保藏和使用技術(shù),浙江省食品藥品檢驗(yàn)所王知堅(jiān),2,菌種保藏和使用的有關(guān)概念菌種保藏和使用的有關(guān)法規(guī)我所現(xiàn)有菌種保藏管理規(guī)程基層單位可以使用的菌種保藏使用技術(shù)有關(guān)菌種問題的答復(fù),3,概念,標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希

2、望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對(duì)接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。,4,中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株,5,美國(guó)國(guó)家菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株,6,法國(guó)生物梅里埃公司提供的商業(yè)派生菌株（Bioball),7,我所現(xiàn)在保藏的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株,8,我所以往保藏的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株,9,我所制備的工作菌株,10,法規(guī),中國(guó)藥典2005年版中國(guó)藥典2010年版實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則其他行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),11

3、,中國(guó)藥典2005年版無(wú)菌檢查法：靈敏度檢查項(xiàng)下 菌種 培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。微生物限度檢查法：細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下 菌種 同無(wú)菌檢查法,12,中國(guó)藥典2010年版在方法的附錄中對(duì)菌種的規(guī)定同2005年版在新增的“藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則”中對(duì)菌種有了較為明確的規(guī)定允

4、許使用標(biāo)準(zhǔn)菌株和商業(yè)派生菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)按保藏機(jī)構(gòu)提供的說(shuō)明進(jìn)行復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株,13,實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可準(zhǔn)則檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明（CNAS-CL09）實(shí)驗(yàn)室必須保存有滿足試驗(yàn)

5、需要的標(biāo)準(zhǔn)菌種或參照標(biāo)本標(biāo)準(zhǔn)菌種或標(biāo)本必須從認(rèn)可的菌種或標(biāo)本收集途徑獲得。實(shí)驗(yàn)室必須建立和保存其所有菌種、標(biāo)本的收集、貯藏、保存、確認(rèn)試驗(yàn)的記錄實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有文件化的程序管理參照菌種（從原始菌種到日常工作用菌）。該程序應(yīng)包括：參照菌種必須定期轉(zhuǎn)種傳代，并做確認(rèn)試驗(yàn)，包括實(shí)驗(yàn)室中所需要的關(guān)鍵診斷指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)室必須加以記錄并予以保存,14,每一支參照菌種都應(yīng)以適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽、標(biāo)記或其它標(biāo)識(shí)方式來(lái)表示其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期和所傳代數(shù)其管理記錄

6、中還應(yīng)包括（但不限于）以下內(nèi)容：從原始菌種傳代到工作用菌種的代數(shù)；菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基及孵育條件；菌種生存條件。,15,其他行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測(cè)（GB/T 27405-2008）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制訂并實(shí)施特定程序管理和使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物來(lái)驗(yàn)收培養(yǎng)基、驗(yàn)證方法和評(píng)估實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)室可使用來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有特性等效的商業(yè)派生菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株傳代培養(yǎng)一次，制得標(biāo)

7、準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株，同時(shí)應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。建議使用深度冰凍或凍干的方法制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)繼代培養(yǎng)獲得工作菌株。一旦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株被解凍，最好不要重新冷凍和再次使用。工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)生變化經(jīng)驗(yàn)證不符合規(guī)定應(yīng)及時(shí)銷毀。,16,我所的菌種管理規(guī)程,菌種的采購(gòu)菌種的復(fù)蘇菌種的傳代菌種的保藏菌種的使用和銷毀,17,菌種的采購(gòu)每年年底，由實(shí)驗(yàn)室菌種管理人員提出下一年度菌種

8、采購(gòu)的計(jì)劃，計(jì)劃購(gòu)置的菌種一般為藥典收載的標(biāo)準(zhǔn)菌種，填寫請(qǐng)購(gòu)單，經(jīng)批準(zhǔn)后，由所采購(gòu)部門向指定的菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)置。所購(gòu)菌種均為冷凍干燥菌種。 采購(gòu)部門購(gòu)入菌種后，應(yīng)及時(shí)移交實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室菌種管理人員應(yīng)仔細(xì)核對(duì)菌種發(fā)放單和冷凍干燥菌種管標(biāo)簽等各項(xiàng)信息，確認(rèn)無(wú)誤后，置4～6℃暫存。,18,菌種的復(fù)蘇菌種在打開前應(yīng)仔細(xì)核對(duì)標(biāo)簽上菌名、菌號(hào)。并注意一株菌種使用一套打開用具，嚴(yán)防交叉污染。 菌種復(fù)蘇應(yīng)在生物安全柜內(nèi)操作。 大腸埃希菌、金黃

9、色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同時(shí)接種液體培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基斜面，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、藤黃微球菌和黑曲霉可接種瓊脂培養(yǎng)基斜面。 取瓊脂培養(yǎng)基斜面上的菌苔按要求對(duì)菌種的純度進(jìn)行鑒定。,19,菌種的傳代應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行菌種的傳代 。取經(jīng)過(guò)純度鑒定的第1代菌種管（瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物）用于傳代制備第2代菌種。接種完畢，液體培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基斜面應(yīng)在規(guī)定的溫度下培養(yǎng)適宜的時(shí)間，芽孢桿菌宜培養(yǎng)5～6天

10、，黑曲霉宜培養(yǎng)5～7天，其他菌種一般培養(yǎng)18～24小時(shí)。,20,菌種的保藏保存的容器為無(wú)菌凍存管，保藏溫度為-70℃。 在冷凍前，應(yīng)貼上菌種標(biāo)簽。標(biāo)簽內(nèi)容應(yīng)包括菌名、菌號(hào)、傳代日期和有效期。所有凍存管應(yīng)立即置低溫冰箱中，迅速冷凍。該方法保藏菌種的有效期規(guī)定為6個(gè)月 。,21,菌種的使用和銷毀本所保藏的菌種主要供本所檢驗(yàn)工作使用并可對(duì)外提供給有關(guān)涉藥單位。本所提供的菌種為第二代低溫冷凍菌種。 本所檢驗(yàn)工作所需菌種，領(lǐng)用人應(yīng)向菌

11、種管理人員領(lǐng)取，并在《菌種領(lǐng)用記錄》上記錄菌名、數(shù)量、領(lǐng)用人等信息。 外單位向我所購(gòu)買菌種，應(yīng)憑單位介紹信，并注明菌名、菌號(hào)、數(shù)量，必要時(shí)可預(yù)約購(gòu)買。本所保藏的菌種，一般應(yīng)每年更換原種（每年打開一套冷凍干燥菌種傳代制備第1代原種保存）。過(guò)期菌種應(yīng)及時(shí)銷毀，銷毀時(shí)應(yīng)經(jīng)121℃ 20分鐘的生物滅活處理。,22,我所對(duì)外提供菌種時(shí)所附的菌種使用說(shuō)明和發(fā)放證明 菌種證明（2009年版）.doc,23,基層單位可使用的技術(shù),

12、通過(guò)制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏的方法通過(guò)制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種進(jìn)行菌種保藏的方法,24,通過(guò)制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏的方法從我所采購(gòu)超低溫冷凍的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株（第二代）將所購(gòu)菌株置4～6℃暫存，并盡快制備工作菌種準(zhǔn)備足夠數(shù)量的瓊脂斜面培養(yǎng)基在生物安全柜內(nèi)取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株1接種環(huán)，劃線接種至斜面上，重復(fù)操作直至所有斜面均被接種將所有斜面培養(yǎng)基置適宜的溫度培養(yǎng)適宜的時(shí)間觀察培養(yǎng)的情況，取其中1支進(jìn)行鏡檢和必要的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)符合要求的工作

13、菌種進(jìn)行必要的標(biāo)識(shí)，置4～6℃保藏（第三代）在規(guī)定的保存期內(nèi)，取上述斜面培養(yǎng)物用于各種實(shí)驗(yàn)至失效期前，取其中1支重復(fù)接種斜面培養(yǎng)基，制備第四代工作菌種,25,通過(guò)制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏的方法優(yōu)點(diǎn)操作簡(jiǎn)便成本低比較容易掌握缺點(diǎn)保存期比較短反復(fù)傳代有引起變異的可能,26,27,通過(guò)制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種進(jìn)行菌種保藏的方法準(zhǔn)備低溫冰箱，溫度應(yīng)能達(dá)到-30℃，最好能夠裝備超低溫冰箱，溫度達(dá)到-70℃準(zhǔn)備適宜的液體培養(yǎng)基將采購(gòu)

14、來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株在生物安全柜內(nèi)吸取適量接種至液體培養(yǎng)基中將培養(yǎng)基置適宜溫度培養(yǎng)適宜時(shí)間取適量培養(yǎng)物進(jìn)行鏡檢和必要的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)符合要求后，在生物安全柜內(nèi)，向上述液體培養(yǎng)物中加入15～20％（V/V）的無(wú)菌甘油，混勻取1～2ml上述混合物，置無(wú)菌凍存管或無(wú)菌離心管內(nèi)進(jìn)行必要的標(biāo)識(shí)置低溫冰箱中冷凍取凍存管1支，解凍后，制備當(dāng)月使用的工作菌種,28,通過(guò)制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種進(jìn)行菌種保藏的方法優(yōu)點(diǎn)保存期較長(zhǎng)反復(fù)傳代導(dǎo)致菌種變異的

15、風(fēng)險(xiǎn)較小缺點(diǎn)操作相對(duì)復(fù)雜成本較高操作流程相對(duì)較長(zhǎng)，受到污染的風(fēng)險(xiǎn)較高,29,,通過(guò)制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種進(jìn)行菌種保藏的模式圖,30,有關(guān)菌種問題的答復(fù),陽(yáng)性菌的制備：領(lǐng)取工作菌種，從斜面上取一定量的培養(yǎng)物，稀釋至系列梯度的菌懸液，分別測(cè)各梯度菌懸液的菌落數(shù)。臨用時(shí)，取相應(yīng)稀釋菌懸液用于陽(yáng)性試驗(yàn)，同時(shí)用平皿法測(cè)定加入的菌液中的菌落數(shù)。是否可行？對(duì)照用菌液的制備應(yīng)取工作菌種，接種置適宜的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后獲得濃菌液，再進(jìn)行稀釋和確定

16、菌濃度,31,菌種鑒定簡(jiǎn)單的講可以采用目前比較成熟的商品化鑒定技術(shù)，如API鑒定條基本程序?yàn)椋簩?duì)疑似菌種進(jìn)行純培養(yǎng)進(jìn)行染色鏡檢根據(jù)染色情況，并結(jié)合顯色培養(yǎng)基等鑒定的初步信息，選擇合適的鑒定條根據(jù)操作說(shuō)明書，得到各生化反應(yīng)的鑒定結(jié)果，通過(guò)查閱檢索表，得到菌種鑒定的初步結(jié)果也可以采用半自動(dòng)或全自動(dòng)的微生物鑒定系統(tǒng),32,請(qǐng)教黑曲霉及白色念珠菌具體傳代及培養(yǎng)技術(shù)，操作中有何注意點(diǎn)？采用的培養(yǎng)基應(yīng)為改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖

17、瓊脂培養(yǎng)基傳代操作建議在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行白色念珠菌斜面培養(yǎng)基的傳代：取斜面培養(yǎng)的菌種管，用接種環(huán)取1白金耳，在待接種的培養(yǎng)基斜面上劃線接種，培養(yǎng)即可液體培養(yǎng)基的傳代：取液體培養(yǎng)的菌種管，用毛細(xì)吸管取適量，在待接種的培養(yǎng)基斜面上涂布接種，培養(yǎng)即可培養(yǎng)條件：20～25℃，24小時(shí),33,黑曲霉斜面培養(yǎng)基的傳代：取斜面培養(yǎng)的菌種管，用滅菌水或滅菌生理鹽水（也可以按照2010年版藥典公示稿的方法）3～5ml洗脫孢子，吸取孢子懸液，在

18、待接種的培養(yǎng)基斜面上涂布接種，培養(yǎng)即可孢子懸液的傳代：取孢子懸液，用毛細(xì)吸管取適量，在待接種的培養(yǎng)基斜面上涂布接種，培養(yǎng)即可培養(yǎng)條件：20～25℃，4～5天注意點(diǎn)減少形成氣溶膠的操作佩戴手套和口罩進(jìn)行操作,34,生孢梭菌計(jì)數(shù)：用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒皿，厭氧罐培養(yǎng)長(zhǎng)不出來(lái)，經(jīng)確認(rèn)菌是有活性的，厭氧指示顏色正確，-5，-6，-7均無(wú)菌落生長(zhǎng)對(duì)于生孢梭菌的計(jì)數(shù)，建議將所有稀釋級(jí)均注皿培養(yǎng)培養(yǎng)中的厭氧環(huán)境對(duì)生長(zhǎng)與否是決定性的有條件的

19、實(shí)驗(yàn)室建議采用厭氧培養(yǎng)工作站小型的厭氧培養(yǎng)可采用厭氧培養(yǎng)罐，但應(yīng)嚴(yán)格按照使用說(shuō)明操作，注意厭氧試劑、厭氧指示劑、催化劑的有效性,35,如何對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯，傳代之前是否一定要做微生物學(xué)鑒定，確認(rèn)是否有變異。復(fù)壯的方法應(yīng)根據(jù)待復(fù)壯的菌種的保藏形式來(lái)確定。對(duì)凍干菌種，復(fù)壯操作較為繁瑣微生物傳代中的菌種確認(rèn)是必須的,36,陽(yáng)性對(duì)照是否必須購(gòu)買菌種？菌種應(yīng)該怎樣保存？有效期一般為多長(zhǎng)時(shí)間？對(duì)照用菌種應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)菌種，一般應(yīng)外購(gòu)保存方法如前

20、述有效期根據(jù)不同菌種，不同的保藏方法而異，如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的細(xì)菌有效期一般為1個(gè)月，能形成芽孢的細(xì)菌有效期一般為3個(gè)月，真菌的有效期為3個(gè)月。,37,銅綠假單胞菌在半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不是很好，應(yīng)如何保藏較好？菌種銅綠假單胞菌保存時(shí)放冰箱好還是室溫好，貯存過(guò)程中菌種變色是否不能使用？因銅綠假單胞菌有運(yùn)動(dòng)性，因此在半固體培養(yǎng)基中穿刺培養(yǎng)后無(wú)法形成穿刺線。接種時(shí)，將半固體取出直接在培養(yǎng)基上涂布即可。也可以采用超低溫冷

21、凍的方式保藏，效果好斜面保藏的菌種在冰箱中放置應(yīng)注意控制溫度，一般不宜低于4℃，也可以放置在室溫中，但應(yīng)控制溫度不超過(guò)25 ℃。菌種保存過(guò)程中，的確會(huì)存在色素退化 的情況，此時(shí)對(duì)菌種進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即可重新表現(xiàn)出色素，仍可使用。,38,今年購(gòu)買的菌液接種后，生長(zhǎng)出來(lái)較稀薄，是否因?yàn)榛靹虻年P(guān)系，但放置菌液的瓶子混勻感覺也不是安全，請(qǐng)問是否有更好的方法，或者是否能仍提供固體培養(yǎng)基的菌種建議采用瓊脂斜面培養(yǎng)基復(fù)壯上述超低溫冷凍標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。

22、從這些斜面培養(yǎng)基上取培養(yǎng)物接種，制備工作用濃菌液，其濃度可以得到保證,39,短小芽孢桿菌如何鑒定通過(guò)顯微鑒別，為不呈鏈狀排列的桿菌，革蘭氏染色為陽(yáng)性。營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑，薄，閃光，蔓延，不粘著，常常是淺黃色。 生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原 ，結(jié)果為明膠緩慢液化，淀粉水解陰性，硝酸鹽還原陰性。采用API鑒定條，結(jié)合染色鏡檢和接觸酶實(shí)驗(yàn)等結(jié)果,40,菌種傳代至第5代時(shí)，還能不能用該斜面菌種接種制備工作用菌液嚴(yán)格

23、講，這種操作是不符合藥典規(guī)定的。藥典所指的傳代次數(shù)不超過(guò)5代，應(yīng)該是指用于實(shí)驗(yàn)的工作用菌液。因此，從保藏的角度看，制備成的斜面保藏菌種只能到第4代。,41,菌種的常識(shí)，如菌種的保存、適宜的生長(zhǎng)環(huán)境及存活時(shí)間、常見菌種的形態(tài)細(xì)菌：斜面保藏法：一般使用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，生孢梭菌使用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，在30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。存活時(shí)間1～3個(gè)月。低溫冷凍保藏法：一般使用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，生孢梭菌使用液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，在30～