血型的鑒定方法及操作

1、紅細(xì)胞血型系統(tǒng)及其檢測,重慶醫(yī)科大學(xué)臨床血液教研室,血型的發(fā)現(xiàn),1900年，ABO血型系統(tǒng)1940年，Rh血型系統(tǒng) Karl Landsteiner,,血型（blood type),狹義地講，存在于紅細(xì)胞上的特異性同種抗原。廣義地講，是人類遺傳多態(tài)性的一種表現(xiàn)，血液中各種成分都有其各自型別。,紅細(xì)胞血型（系統(tǒng)，抗原）,是存在于紅細(xì)胞上的化學(xué)結(jié)構(gòu)，化學(xué)本質(zhì)是糖和多肽，是紅細(xì)胞膜上的跨膜蛋白。

2、存在于紅細(xì)胞膜上（完全抗原），也存在于上皮細(xì)胞以及各種體液和分泌液中（半抗原）。,RBC,,存在于體液、分泌液中,紅細(xì)胞血型抗體,天然抗體、免疫抗體規(guī)則抗體、不規(guī)則抗體完全抗體，不完全抗體同種抗體，自身抗體,天然抗體和免疫抗體,天然抗體：ABO血型系統(tǒng)中，A型個體血漿中天然存在抗B，B型個體血漿中存在抗A。多數(shù)天然抗體是IgM型，最佳反應(yīng)溫度為室溫或更低。免疫抗體：一般通過輸血、妊娠、注射三種方式接受抗原刺激，多數(shù)免疫抗體

3、是IgG型，最佳反應(yīng)溫度是37oC。,天然抗體和免疫抗體特性比較,,,規(guī)則抗體和不規(guī)則抗體,規(guī)則抗體：ABO系統(tǒng)產(chǎn)生抗Ａ、抗Ｂ是有規(guī)律的?！andsteiner規(guī)律：　Ａ型－抗Ｂ，Ｂ型－抗Ａ，Ｏ型－抗Ａ，抗Ｂ不規(guī)則抗體：除ABO 系統(tǒng)外，其他系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體均不符合上述規(guī)律?！≌Ｈ搜褐幸话銢]有不規(guī)則抗體，又稱為意外抗體（unexpected antibody）。,完全抗體和不完全抗體,完全抗體：在鹽水介質(zhì)中能凝集紅細(xì)胞抗體

4、，多為IgM抗體。不完全抗體：能使紅細(xì)胞致敏，但在鹽水質(zhì)中不能凝集紅細(xì)胞，需要通過抗球蛋白法或其他非鹽水介質(zhì)法進行檢測，多為IgG抗體。,,抗IgG,同種抗體、自身抗體,同種抗體：針對患者缺乏的抗原所產(chǎn)生的抗體即為同種抗體，如Rh陰性者輸血后產(chǎn)生的抗Ｄ抗體。自身抗體：針對自身抗原產(chǎn)生的抗體，如引起自身免疫型溶血性貧血。,紅細(xì)胞血型,紅細(xì)胞血型分類： ISBT（The International Society of Bl

5、ood Transfusion) 2002年，29個系統(tǒng)，200多個抗原 目前，30個系統(tǒng)，300多個抗原,一、ABO血型系統(tǒng)1. ABO血型抗原和抗體特性,,2.ABO血型的遺傳與生化,（1）ABO基因型與表型 A型——AA，AO B型——BB，BO AB型——AB O型——O A，B是顯性基因，O是隱性基因 ABO基因不是產(chǎn)生ABO抗原的遺傳密碼,（2）ABO血型

6、的生化合成,H基因—— α –L-fucocyltransferase，19chr A基因—— α –N-acetyl-0-galactosaminyltransferase，9chr B基因——galactosyltransferase, 9chrO基因——無效基因，不產(chǎn)生轉(zhuǎn)移酶，O型紅細(xì)胞含有H物質(zhì),,基因,,酶,,合成抗原,思考：A、B、AB型紅細(xì)胞是否存在H物質(zhì)？,,（3）ABH可溶性抗原形成,分泌型血型物質(zhì)：ABH

7、抗原存在于紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，也可出現(xiàn)在除腦脊液外的分泌液中，唾液中最豐富。Se，se基因——與體液分泌有關(guān)，Se編碼α –L-fucocyltransferase，形成分泌液中的H抗原，H也可轉(zhuǎn)化為A或B抗原，Se不影響紅細(xì)胞上ABH形成，Se為分泌型；se為非分泌型；19chr。,分泌型血型物質(zhì)的意義：,在RBC抗原弱表達個體中確定ABO血型。檢測唾液、羊水中的血型物質(zhì)，輔助鑒定血型和預(yù)測胎兒血型。

8、能中和天然抗體（IgM），有助鑒別Ab性質(zhì)。,3.ABO亞型：,亞型：同一血型抗原的結(jié)構(gòu)、性能（質(zhì)）或抗原位點數(shù)（量）存在一定差異。A亞型：A1，A2，A3，Ax，Ay，AmB亞型：B1，B2，B3，Bx，Bm,二、Rh血型系統(tǒng),1940年，Landerstein和Wiener用恒河猴（rhesus）RBC免疫家兔或豚鼠，得到一種抗體，可與85%白種人紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。Rh系統(tǒng)有50個抗原，最復(fù)雜，重要性僅次于ABO血型。

9、,1.遺傳與發(fā)育規(guī)律,胎兒早期充分發(fā)育，臍帶血/新生兒紅細(xì)胞同成人?；蛭挥?chr，分別命名為RHD，RHCE，RHD編碼D抗原，RHCE編碼不同組合的CE抗原，ce，cE，Ce，CE。,,2.命名和種類,三種命名方式 Fisher-Race、數(shù)字命名法、現(xiàn)代命名法,Fisher-Race命名法（CDE命名法）,,3.Rh血型種類,D、E、C、e、c抗原的強弱次序 D>E>C>c>e

10、,5.Rh抗體,Rh抗體產(chǎn)生 天然抗體罕見 主要通過輸血和妊娠免疫產(chǎn)生IgG 初次免疫后3~6月出現(xiàn)，再次免疫后3周達高峰Rh抗體種類 抗D，抗E，抗C，抗c，抗e,ABO和Rh血型系統(tǒng)的臨床意義,安全輸血的主要保證新生兒溶血病的診斷器官移植的必要條件其他：遺傳學(xué)研究，法醫(yī)學(xué)鑒定,四、ABO和Rh血型鑒定,常用方法： 鹽水介質(zhì)法、酶介質(zhì)法、抗人球蛋白法、聚凝胺法 試管法、玻片法、

11、微柱凝膠法,1.鹽水介質(zhì)法（salt medium test）,原理：根據(jù)IgM類抗體與紅細(xì)胞膜上特異性抗原能發(fā)生凝集反應(yīng)。 正定型：已知血型抗體試劑 + 紅細(xì)胞 反定型：已知標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞 + 血清,,鑒定紅細(xì)胞上血型抗原,,鑒定血清中抗體,,反應(yīng)條件：生理鹽水介質(zhì)，室溫，肉眼可見凝集反應(yīng)平板法，試管法，微孔板法，試管離心法最可信賴。應(yīng)用：ABO血型定型、RhD抗原定型（IgG+IgM，IgM單克隆抗體），

12、交叉合血,結(jié)果判斷,,注意事項（一）：,標(biāo)準(zhǔn)血清：健康壯年人混合血清，培養(yǎng)細(xì)胞株的單克隆抗體要求： 高效價：抗A、抗B≥1：128 高親和性：15s內(nèi)出現(xiàn)凝集，3min后凝集塊 > 1mm2 單克隆抗體具有檢出A2，A2B的能力 冷凝集素效價< 1：4 無菌，病毒滅活,注意事項（二）：,紅細(xì)胞試劑：三個健康者同型新鮮紅細(xì)胞混合，用生理鹽水洗滌三次。紅細(xì)胞懸液不能過濃或過淡，5%生理鹽水

13、紅細(xì)胞懸液,注意事項（三）：,所有器材清潔干燥一般先加血清，后加紅細(xì)胞反應(yīng)溫度：IgM抗體反應(yīng)最適溫度為40C，為防止冷凝集素干擾，采用室溫，370C反應(yīng)減弱離心時間和速度：3000g,30s反定型不宜用玻片法結(jié)果核對，避免筆誤正、反定型結(jié)果一致才能報告，否則查找原因,正反定型不一致的可能原因（一）：,操作技術(shù)上的錯誤：主要原因 離心過度或不足 細(xì)胞與血清反應(yīng)比例不適當(dāng) 陽性反應(yīng)產(chǎn)生溶血現(xiàn)象而未能識

14、別 漏加試劑、結(jié)果判讀錯誤等,正反定型不一致的可能原因（二）：,出現(xiàn)假陰性的常見原因： 某些白血病患者和難治性貧血等導(dǎo)致ABO抗原減弱； 免疫系統(tǒng)尚未健全的新生兒、4月~6月內(nèi)嬰兒、抗體水平下降的老人； 亞型紅細(xì)胞抗原性弱，難以檢出； 低丙種球蛋白血癥患者，血清定型時不凝集或弱凝集。,正反定型不一致的可能原因（三）,出現(xiàn)假陽性的常見原因： 紅細(xì)胞出現(xiàn)多凝集現(xiàn)象； 嚴(yán)重腸道革蘭氏

15、陰性桿菌感染，可使紅細(xì)胞獲得類B現(xiàn)象； 異常的血漿蛋白升高、白蛋白/球蛋白異常，高濃度纖維蛋白原造成假凝集現(xiàn)象； 待檢血清中有不規(guī)則抗體存在； 右旋糖酐、靜脈注射某些造影劑等引起紅細(xì)胞 類似凝集。,方法學(xué)評價,簡單，靈敏度低，只適合IgM抗體試管法：需時短，離心增強凝集，可發(fā)現(xiàn)亞型和較弱的反應(yīng)，正、反定型皆適合玻片法：適合大規(guī)模血型普查，反應(yīng)時間長，有時漏掉弱反應(yīng)，反定型不適合。,2.酶介質(zhì)法（enzymic me

16、dium test）：,,原理和方法：主要用于Rh血型鑒定（IgG抗體）,蛋白水解酶,,,,增強IgG抗體的凝集作用,注意事項：,Rh血型不需作反定型每次實驗均需作陽性、陰性對照,方法學(xué)評價,簡單經(jīng)濟穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性較差，不能檢出MN、Duffy血型系統(tǒng),3.抗人球蛋白實驗（Coomb’s test）,原理和方法,抗IgG,,待測紅細(xì)胞 + 抗RhD（IgG）+ 抗人球蛋白,紅細(xì)胞凝集,應(yīng)用延伸：,檢測紅細(xì)胞同種抗體的經(jīng)典方法，

17、新生兒溶血、病、溶血性輸血反應(yīng)、自身免疫性溶血性貧血直接Coomb’s（direct antiglobulin test, DAT）間接Coomb’s（indirect antiglobulin test, IDAT）,DAT：檢查紅細(xì)胞是否致敏,,,IDAT：檢測血清中不完全抗體,,,4.聚凝胺介質(zhì)法（polybrene test）,原理和方法 低離子強度鹽溶液（low ionic strength salt soluti

18、on, LISS)：降低介質(zhì)離子強度，增加抗原抗體結(jié)合 聚凝胺：中和紅細(xì)胞表面負(fù)電荷，使紅細(xì)胞發(fā)生非特異性凝集。 重懸液（resuspension),方法學(xué)評價,適于各類抗體（IgM，IgG）快速、靈敏、可靠對檢測Kell血型系統(tǒng)抗體不理想，不能用肝素抗凝。,5.微柱凝膠法(gel cards with microtubes),,1986年法國人Dr. Yves Lappierre發(fā)明1994年，獲美國FDA認(rèn)證

19、,原理和方法,葡聚糖做成微型凝膠柱，上端為反應(yīng)室，下端凝膠柱為抗原抗體凝集反應(yīng)的介質(zhì)。抗原與抗體結(jié)合后離心，經(jīng)過凝膠分子篩作用，游離紅細(xì)胞在凝膠底部，而與抗體結(jié)合凝集的紅細(xì)胞位于凝膠上部或懸浮于凝膠中。,,反應(yīng)室,凝膠柱,結(jié)果判讀：,陽性結(jié)果：紅細(xì)胞凝集塊位于凝膠表面或凝膠中，和（或）出現(xiàn)溶血。,,注意事項：,專用水平離心機假陽性：鐮型紅細(xì)胞、巨幼紅細(xì)胞 白細(xì)胞過多

20、 纖維蛋白原未完全去除 細(xì)菌污染，血漿蛋白異常假陰性：抗原抗體比例不合適不適用于直接Coombs陽性的紅細(xì)胞標(biāo)本、酶處理的紅細(xì)胞標(biāo)本,方法學(xué)評價,靈敏度和準(zhǔn)確性高，實驗結(jié)果重復(fù)性好，可長時間保存自動化程度高，實驗過程標(biāo)準(zhǔn)化，ISO9000/CE認(rèn)證成本高,,,應(yīng)用延伸：用于ABO正反定型，交叉配血、其他血型抗原檢測（CcEe）、不規(guī)則抗體檢測、Coombs實驗,凝膠柱,,,,中性膠,抗人