大腸桿菌o157h7實驗診斷研究進展

1、大腸桿菌O157: H7實驗診斷研究進展,大腸桿菌O157: H7感染臨床表現(xiàn),出血性腸炎：鮮血樣便，腹部痙攣性疼痛，低熱或不發(fā)熱。 溶血性尿毒綜合征（HUS）：主要發(fā)生在兒童，常出現(xiàn)在腹瀉后數(shù)天或1-2周。病死率一般在10%，各別可高達50%。血栓性血小板減少性紫癜（TTP）：主要發(fā)生在成年人，尤其老年人。病人主要表現(xiàn)為發(fā)熱、血小板減少、溶血性貧血、腎功能異常等癥狀，病情發(fā)展迅速，病死率高，有時可出現(xiàn)70%的病人死亡。,大腸桿菌

2、O157: H7傳染源和傳播途經(jīng),大腸桿菌O157: H7基本上是一種食源性病原菌，可通過食用大腸桿菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、雞肉、蔬菜、水果、飲料、水等感染,也可通過人與人、人與動物密切接觸傳播。在實驗室，大腸桿菌O157: H7可以感染小鼠、雞、兔、豬、牛等動物。大腸桿菌O157: H7的感染已成為世界性的問題我國情況也不容樂觀,一、細菌培養(yǎng)與鑒定,1．分離培養(yǎng)早期培養(yǎng)對確定病原有重要意義。 培養(yǎng)的對

3、象首先是急性血性腹瀉患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接觸者。培養(yǎng)基：山梨醇麥康凱瓊脂、胰胨大豆瓊脂改良的伊紅美蘭 、改良的SD-39（MSD）瓊脂 添加了頭孢克肟 和 亞碲酸鉀的山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）添加了頭孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麥康凱瓊脂（CR-SMAC）“科瑪嘉”大腸桿菌O157: H7顯色培養(yǎng)基四溴熒光亞甲基蘭瓊脂H7抗血清—山梨醇發(fā)酵培養(yǎng)基,,增菌液：含10mg/L 新

4、生霉素的EB肉湯或腸道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L鹽酸-吖啶黃的胰蛋白胨大豆肉湯新生霉素MEC肉湯月桂基胰蛋白胨肉湯加入下例任何一種抑制劑均可增加培養(yǎng)基的選擇性頭孢克肟 0.05mg/L 亞碲酸鉀2.5mg/L 新生霉素10mg/L 萬古霉素40mg/L,,2．免疫磁珠分離法,免疫磁珠分離法是將特異性抗體吸附于一種能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗體反應特性將樣品中的大腸桿菌O157:

5、 H7富集起來。方法:1.增菌;2.取樣品1ml加大腸桿菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.輕輕混合10分鐘;4.將試管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重復3-5過程;7.取管壁沉淀物,劃線接種于CT-山梨醇麥康凱瓊脂(C-頭孢克肟,T-亞碲酸鉀)等選擇性培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)6-24小時，挑取可疑菌落進行鑒定。,Chapman等 共檢測大便標本690份, 免疫磁珠分離法檢出25 。用免疫磁珠分離法分離的l2株大腸桿菌O157

6、: H7中,直接培養(yǎng)陽性僅5株。Wright等將接種大腸桿菌O157: H7的碎牛肉標本置加有萬古霉素和頭孢克肟的緩沖蛋白胨水培養(yǎng),然后直接或用大腸桿菌O157抗體包被的磁珠分離細菌后,接種于CT-SMAC,結(jié)果直接次培養(yǎng)檢出量為200cfu/g,而免疫磁珠分離法僅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉湯增菌,然后用免疫磁珠分離法富集牛糞便大腸桿菌O157: H7菌株,再用選擇性培養(yǎng)基分離，并與CR-SMAC和CT-MAC直

7、接培養(yǎng)作比較。用前者檢測接種12株不同大腸桿菌O157: H7菌株的牛糞便懸液,其敏感性比在兩種培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)高100倍。 Cubbon等用免疫磁分離法（IMS）檢測牛糞便和食品標本的大腸桿菌O157: H7。在一起經(jīng)牛奶傳播的大腸桿菌O157: H7爆發(fā)中,用IMS、糞便培養(yǎng)和多聚酶鏈反應(PCR)檢測Vero毒素基因的攜帶,用三種方法對糞便大腸桿菌O157: H7的分離率作比較結(jié)果,在受檢的142份糞便標本中,直接培養(yǎng)和IMS

8、均陽性20 份,另13份僅IMS陽性。因此,IMS提高了大腸桿菌O157: H7感染病例的檢出率,與PCR符合率高。,,目前，污染的肉、家畜，甚至飲用水均面臨大腸桿菌O157: H7的衛(wèi)生威脅。檢測食品和水源中腸道病原體使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法,結(jié)果不理想。IMS和其它檢測的研究表明,對快速檢測食品和環(huán)境標本似乎前景良好,Yu檢等以IMS結(jié)合電化學發(fā)光檢測法(ECL)檢測食品和污染物中的大腸桿菌。結(jié)果顯示,在原緩沖液檢出大腸腸菌的范固為100－

9、1000 cfu/lm,在食品檢出的范圍為1000－2000cfu/lm ，檢測時間十分快,一般不到1小時。菌O157: H7菌株的牛糞便懸液,其敏感性比在兩種培養(yǎng)基上直接培養(yǎng)高100倍。在監(jiān)測牛群的4個月間,從牛采集1024份直腸標本,其中檢出大腸桿菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培養(yǎng)和IMS分離。23份中15份由兩種培養(yǎng)基、5份僅由CT-SMAC、3份僅由CR－SMAC分離,其余61份(72.

10、6%)僅IMS分離。用含吐溫－20 的PBS洗滌磁珠可減少其它微生物與磁珠的非特異性結(jié)合。用無關的抗體包被磁,則大腸桿菌O157: H7不結(jié)合。IMS具有快速、操作簡單、特異性高,在流行病學調(diào)查中有價值。,3．生化反應,目前許多國家使用的O157和 H7特異性抗體與極少數(shù)細菌具有不同程度交叉反應。因此用生化試驗確定為大腸桿菌是必須的。典型大腸桿菌的主要生化反應結(jié)果如下：動力試驗（+） 葡萄糖（+） 麥芽糖（+）甘露醇（+）

11、 蔗糖（－/+） 硫化氫（－） 尿素（－） 靛基質(zhì)（+） 甲基紅（+） V-P試驗（－）枸櫞酸鹽（－）苯丙氨酸脫羧酶（－）賴氨酸脫羧酶（+/－）鳥氨酸脫羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化鉀（－）與O157有鑒別意義的生化反應見表1。MUG即4-甲基傘形化內(nèi)酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多數(shù)大腸桿菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG產(chǎn)生熒光, 但O157: H7中大多數(shù)菌株則不水解MUG。Thompson等建立了一種快

12、速MUG試驗,取 MUG試劑0.5ml置試管中,以無菌棉簽挑取待檢菌純培養(yǎng)物混勻于其中,44.5℃置20min,暗室內(nèi)高強度光源下觀察結(jié)果,產(chǎn)生藍色熒光者為陽性。,二．血清學檢測,1．玻片凝集試驗2. 膠體金免疫技術(shù)3. ELISA 4．免疫熒光技術(shù)5．膠乳凝集 6. 間接血凝分析(IEHA)7. 全自動抗原抗體檢測系統(tǒng)8. 免疫印記法,1．玻片凝集試驗,玻片凝集試驗是鑒定O抗原最經(jīng)典的方法,實驗中如果凝集反應不明

13、確，但根據(jù)臨床表現(xiàn)和生化反應等菌株高度可疑時,可100℃加熱菌液30min再行玻片凝集試驗。這樣可去除K抗原的影響。為排除交叉反應引起的凝集造成假陽性,應繼而做試管凝集反應,所測得的效價不應低于診斷血清原標定效價的一半。鑒定H抗原也應同時做玻片和試管凝集試驗,并應先對待檢菌做動力試驗,在動力活潑時取培養(yǎng)物做H抗原鑒定。,2. 膠體金免疫技術(shù),膠體金免疫技術(shù)特點是以膠體金作為標記物進行的抗原抗體反應。這一技術(shù)最初用于免疫電鏡技術(shù)。至今，在

14、免疫測定中，金標記常與膜載體配合，形成特定模式，典型的如斑點免疫滲濾試驗和斑點免疫層析試驗等，已是目前應用廣泛的一種簡便、快速的血清學檢驗方法。膠體金的制備多采用還原法，氯金酸是主要還原材料。金顆粒的大小取決于制備時加入的檸檬酸三鈉的量。,膠體金免疫層析試驗時以硝酸纖維膜為載體，利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一樣。,,,,,,,,,,,,,,陰性：出現(xiàn)一條線 陽性：出現(xiàn)

15、兩條線 無效：無線,中國預防醫(yī)學科學院微生物研究所利用膠體金技術(shù)、雙抗體夾心法和顯色反應等特點，研制了大腸桿菌O157: H7病原體快檢金卡，通用于定性檢測糞便、食品、水等樣品中的O157: H7大腸桿菌。顯色程度與樣品中細菌含量成正比，最低測菌量為少于100個菌細胞，主要特點是敏感性高，可用于待檢樣品初篩，陽性樣品可進行細菌分離，減少工作量。,3. ELISA,大腸桿菌O157: H7的常用檢測方法是糞便培養(yǎng)后作細

16、菌分離,然后用生物化學和免疫學方法鑒定,一般需72 小時。Dylla等用一種快速ELISA直接檢測糞便中大腸桿菌O157: H7,并與標準培養(yǎng)方法加以對照。結(jié)果顯示,ELISA檢測183份糞便標本,檢出大腸桿菌O157: H7 9份。常規(guī)培養(yǎng)法陰性176份,而ELISA陰性174份?？偺禺愋詾?8.9%。該法與其它非O157: H7大腸桿菌無交叉反應,是一種準確、敏感、特異、易觀察結(jié)果的篩選方法，尤其適用于中、小實驗室及大量糞便標本

17、的流行病學調(diào)查。,Padhye等用單克隆抗體進行直接ELISA反應檢測O157: H7,除O26 ：H11外，未發(fā)現(xiàn)與沙門氏菌、結(jié)腸炎耶氏森菌、志賀氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反應。單克隆抗體用于檢測大腸桿菌O157: H7有明顯特異性，可作為一種免疫試劑用于臨床和食物標本的快速檢測。Clark 等近一步對單克隆抗體的研究發(fā)現(xiàn),此種單克隆抗體識別的物質(zhì)是LPS,這種LPS抗原決定簇用全細胞ELISA同樣可以在其它血清型大腸桿菌和產(chǎn)生或不

18、產(chǎn)生Vero毒素的大腸桿菌中檢測到, 而且易受到膽鹽、吖啶黃和溫度的影響,但可以通過結(jié)合免疫捕獲的修飾方案來提高ELISA的特異性。,4．免疫熒光技術(shù),DEFT 與Ab-DEFT： 直接熒光技術(shù)（DEFT）與抗體定位熒光技術(shù)(Ab－DEFT)的主要特點是,顯微鏡下直接計數(shù)樣品菌細胞。由于無需培養(yǎng)或分離過程,因此檢測非?？焖?。DEFT的基本原理為:對樣品進行過濾,用熒光染料(如吖啶橙)對留在濾膜上的菌細胞染色后,用熒光顯微鏡觀察計數(shù)

19、。但由于熒光染料的非特異染色,不但被檢菌被染色,本底雜菌也可染色,從而影響了結(jié)果的精確性。Ab-DEFT則克服了這一缺點,過濾后的菌細胞與熒光標記的特異抗體作用,然后用熒光顯微鏡觀察計數(shù)。,固相熒光毛細管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、試劑用量少、易于操作等優(yōu)點。Czajlu等用熱殺死的O157: H7菌包被玻璃毛細管作固形支持物。 樣品中加入結(jié)合了生物素的O157: H7多克隆抗體,作用一段時間,然后將此樣品/抗體混合物與標記了

20、Cy5 (一種熒光花青染料)的親和素加入到毛細管,孵育2min,沖洗、吹干,由激光傳感器系統(tǒng)發(fā)射650nm波長激發(fā)光激發(fā)花青染料,之后用光學傳感器系統(tǒng)測定熒光發(fā)射密度。,O157: H7,,生物素,抗體,,親和素,Cy5,,,樣品,,直接免疫熒光抗體染色 Park等對糞便樣品進行離心后,用免疫熒光抗體對糞便涂片進行標記,可檢測到所有培養(yǎng)法證實的菌株,檢測時間<2h。,5．膠乳凝集,該方法是以膠乳顆粒作載體,以O157: H7特異

21、性抗體致敏,制成特異的膠乳試劑,將標本乳化于玻片或有色燒盤上，滴加膠乳試劑,呈明顯凝集而對照膠乳不凝集時即為陽性。,6．間接血凝分析(IEHA),該法多用于對LPS、可溶性本體抗原、未加熱抗原的抗體檢測,對檢測H抗原的抗體效果不佳。Morooka等檢測了溶血性尿毒綜合征(HUS)病人血清LPS抗體,雖然甲醛化羊紅細胞(SRBC)有低水平非特異性吸附,但不影響該方法作為一種有效、快速（<3h）的診斷方法。因為感染病人血清的滴度明顯高

22、于非特異性吸附。,7. 全自動抗原抗體檢測系統(tǒng),VIDAS是一種全自動抗原抗體檢測系統(tǒng)。可直接從感染性疾病患者標本中檢測細菌、病毒、弓形蟲、衣原體和螺旋體等微生物的抗原、抗體或毒素?；驹恚翰捎妹嘎?lián)免疫（夾心法）原理，并在底物中摻入熒光物質(zhì)，最終產(chǎn)生熒光產(chǎn)物4-甲基-7-羥刀豆素，熒光強弱與標本中被測物濃度相關，經(jīng)掃描樣本讀數(shù)與標準比較計算出標準值，并根據(jù)陰性和陽性臨界值判定結(jié)果。,8.免疫印記法,目的是檢測大腸桿菌O157: H7

23、感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特異性 抗體?；驹硎菍⑻峒兊闹嗵腔蛉苎赜肧DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，通過轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后用抗原抗體進行免疫檢測。包括SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)移電泳、免疫檢測三部分。特點是具有比較高的特異性和敏感性 。,免疫檢測 將封閉好的硝酸纖維素膜按梳子齒的寬度剪成每一個泳道一條，依次編號。1) 每條加入1毫升用PBS稀釋的病人血清，室溫震蕩2小

24、時，同時設陽性對照和陰性對照；2) 用2.5毫升／條PBST震蕩洗滌3次，每次5分鐘；3) 加入用1毫升用PBS稀釋的II抗，室溫震蕩1小時；4) 用2.5毫升／條PBST震蕩洗滌2次，每次5分鐘，再用PBS洗滌一次； 5) 將膜放入12毫升顯色液中顯色，室溫震蕩15-30分鐘，至陽性對照出現(xiàn)滿意的藍紫色 ；6) 將膜放入蒸餾水中終止顯色反應，照相；7) 當顯色的條帶和溶血素的分子量或0157脂多糖的條譜一致時，

25、結(jié)果判斷為陽性。,二．分子生物學檢測,分子生物學的出現(xiàn)，為更快診斷微生物提供了許多分子學工具。 這一新的研究是用基因型而不是表型因子來鑒定特異性病原體。因此其特異性更好。加之 操作程序自動化使得DNA分析在實驗室應用中已成為常規(guī)操作。自動化DNA提取儀，聚合酶鏈式反應儀(PCR儀)，DNA序列分析儀，脈沖凝膠電泳儀(用于分離DNA大片段，如完整的染色體) 在疾病診斷中都是很有用的。,1．DNA探針,探針(probe)標記：放射性核素 、

26、非放射性物質(zhì)標記 。探針的來源 ：①克隆的基因組DNA探針；②cDNA探針；⑧RNA探針；④寡核苷酸探針。標本處理：根據(jù)標本來源和量的不同而處理不同 。雜交方法：斑點雜交 、southern印跡 、原位雜交 、Northern印跡 等。雜交信號檢測 ： (1)測量放射性核素射線脈沖數(shù) (2)放射自顯影 (3)顯色法 (4)發(fā)光法。 O157: H7特異噬菌體上的sltⅠ、Ⅱ基因、大質(zhì)粒溶血素基因及染色體上eae基因等都已制成

27、了可雜交檢測的特異探針。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探針進行流行病學調(diào)查。Thomas等用地高辛標記的VT2B亞單位基因、VT2C基因探針檢測不同噬菌體型O157: H7菌。Huck等篩選了O157: H7大質(zhì)粒上限制性片段,發(fā)展了一種2.0kb的Sma I片段探針,認為此探針對O157: H7血清型最為特異,可與所有O157: H7試驗菌雜交。,2. PCR技術(shù),聚合酶鏈式反應

28、技術(shù)（PCR）是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強、敏感性高、快速、簡便、可擴增RNA或cDNA、對起始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點。,PCR技術(shù)擴增體系的基本成分,引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設計的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設計引物鏈時應充分考慮引物特異性。引物長度一般為15-30個堿基,G+C含量為40- 60%,濃度0.1-1umol/L 。

29、TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長可能導致非特異DNA擴增 。模板DNA：應避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。 4×dNTPs ： dNTP儲存液pH應為7.0，在反應體系中，４種dNTP的濃度應相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液

30、及其他成份：PCR反應體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。,PCR技術(shù)循環(huán)參數(shù),PCR擴增是由變性、退火和延伸三個步驟反復循環(huán)而實現(xiàn)的。確定正確的循環(huán)參數(shù)是PCR成功的保證。,循環(huán)參數(shù),1．變性溫度和時間 模板DNA和PCR產(chǎn)物的變性不完全，是PCR反應失敗最常見的一個原因,在變性步驟，使溫度達到雙鏈DNA完全分離的變性條件是95 ℃ ，30s。

31、對GC含量高的靶DNA序列，宜用較高的變性溫度。在解鏈溫度下，DNA的變性僅需幾秒。但是，使反應管內(nèi)達到解鏈溫度需要一定的時間。原則上變性步驟應高溫、短時，即要保證變性充分，又要保持聚合酶在整個反應中的活性。,循環(huán)參數(shù),2．引物退火 引物退火的溫度和時間取決于引物的長度、堿基組成及其在反應體系中的濃度 。對GC含量約50％，長20個堿基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火溫度為55 ℃ 。在溫度較高的條件下退火，可提高PCR的特異

32、性。,循環(huán)參數(shù),3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸溫度取決于DNA聚合酶的最適溫度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步驟的時間則取決于目標序列的長度、濃度和延伸溫度。目標序列越長、濃度越低、延伸溫度越低，則所需的延伸時間越長；反之，目標序列越短、濃度越高、延伸溫度越高，所需的延伸時間則越短 一般而言，每1000個堿基的序列，延伸時間1分鐘便

33、足夠了。對于擴增100—300個堿基的短序列片段，可省去延伸溫度這一步驟，而采用快速簡便的變性、退火雙溫循環(huán)。這是因為TaqDNA聚合酶即使在退火溫度下仍保持很強的活性，而延伸過程可在退火溫度轉(zhuǎn)變?yōu)樽冃詼囟鹊倪^程中完成。,循環(huán)參數(shù),擴增產(chǎn)物長度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃變性時間（秒） 30 30 60

34、 6055℃復性時間（秒） 30 30 60 6072℃延伸時間（秒） 30 38 120 180一般作25-30個循環(huán)即可，進行最后一次循環(huán)時間、延伸時間增加5分鐘。,PCR擴增產(chǎn)物的檢測方法,PCR反應混合物經(jīng)過循環(huán)擴增后，所需做的工作就是檢測反應液中是否存在預期擴增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測

35、分析PCR擴增產(chǎn)物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析、核酸序列分析。,PCR技術(shù)類型,免疫PCR技術(shù) 原位PCR技術(shù) 不對稱PCR技術(shù) 巢式PCR技術(shù) 反向PCR技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù) 復合PCR技術(shù) 彩色PCR技術(shù) 抗原捕獲PCR技術(shù)增敏PCR技術(shù)

36、 酶標PCR技術(shù) 二溫式PCR技術(shù) 錨定PCR技術(shù) 定量PCR技術(shù) 毛細管PCR技術(shù) 多重PCR技術(shù) 巢式或套式PCR技術(shù),PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測中的應用,(1)簡單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎設計了一對引物,擴增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應用煮沸法與基因釋放

37、法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測時間為3h。Thomas等用PCR擴增了slt基因片段。引物：正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測定,檢測時間為ld 。徐建國等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設計了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。,PCR技術(shù)在大腸桿菌O15

38、7: H7檢測中的應用,（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡單PCR,近年來國外學者對多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價值方面進行了研究。Meng等同時擴增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長度分別為633、210、484bp。此引物設計可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個單一反應中同時擴增了eae基因、slt

39、Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質(zhì)粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1087、227、224、166bp。嚴笠選用針對大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對引物,在同一擴增體系中進行PCR,檢測12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結(jié)果復合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽性結(jié)果。能迅速、有效地與其

40、它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。,PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測中的應用,（3）原位PCR:kurokawa等不用培養(yǎng)過程,直接用原位PCR技術(shù)結(jié)合落射顯微鏡,在單細胞水平快速檢測O157: H7 。,4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測中的應用,傳統(tǒng)的細菌分類方法主要依賴于細菌的形態(tài)學、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現(xiàn)代分子生物學理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，微生物檢測進入了基因時代，以核糖體核

41、糖核酸序列為基礎的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡便、敏感和特異等優(yōu)點。,23SrRNA基因特征：原核生物的核糖體有三種大?。ǚ謩e為23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全長序列的菌種數(shù)目已達250種。長度大約為3000pb。對許多細菌的23SrRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其序列的可變性比1

42、6SrRNA基因要明顯，特別是親源關系近的種系。利用這些可變區(qū)序列的差異可對相同菌種不同菌株進行分類鑒定。同時對已知23SrRNA基因序列分析也發(fā)現(xiàn)，在最初的520pb中有6個保守區(qū)域（5-10區(qū)域），并發(fā)現(xiàn)，這6個保守區(qū)域中6區(qū)段和10區(qū)段最保守，該序列在14個菌種中完全一致。應用：檢測臨床感染性疾病的病原菌 首先，將兩條引物設計在保守區(qū)，成為通用引物，而在變異區(qū)中選擇序列作為特異性探針，先用通用引物作PCR擴增，可篩選出含有病原

43、菌的樣本，再用特異性探針與擴增產(chǎn)物進行雜交，對目的細菌作出鑒定，達到診斷病原體及分型的目的。鑒定特定細菌種屬 目前認為，已發(fā)現(xiàn)的23SrRNA基因的IVSs具有種屬特異性，可利用IVSs（插入序列）進行PCR擴增達到對某一種屬細菌的診斷。在流行病學方面的應用利用可變區(qū)序列的差異可對相同菌種不同菌株進行分析。為流行病提供依據(jù)。,除以上介紹的各方法外,常用的有效檢測方法還有脈沖場電泳、隨機擴增多態(tài)性DNA指紋分析、細胞毒試驗等,在此不一

44、一贅述。,大腸桿菌O157: H7的檢驗程序 樣品 增菌6小時 磁珠濃縮 可疑菌落 山梨醇麥康凱瓊脂

45、

46、 G染色 生化反應 血清學 毒力基因,,,,,,,,,,,大腸桿菌O157: H7實驗室診斷依據(jù),有下列情況之一具有實驗室確診意義： 1) 從腹瀉病患者的糞便標本中分離出大腸桿菌O157: H7 ；2) 經(jīng)PCR或DNA雜交試驗證實具有溶血素基因 及志賀樣毒素基因；3) 腹瀉病患

47、者恢復期血清抗O157LPS IgG抗體呈4倍升高；4) 具有血性便的腹瀉患者的急性期血清或恢復期血清，蛋白印記試驗證實含有和O157LPS、EHEC溶血素或志賀毒素的特異性抗體．,小結(jié),自從O157: H7被認識以來,對其基因的研究越來越細,已經(jīng)探明了許多結(jié)構(gòu)與功能基因,對其病因?qū)W、病理學及臨床治療方面均有很大促進作用。由于引起感染所需的O157: H7劑量很低,有必要發(fā)展一些靈敏度高的方法,用于快速有效地檢測。另外,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)存在