microrna31轉(zhuǎn)基因小鼠與昆明小鼠脊髓損傷模型胃腸動力變化的研究

1、microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠與昆明小鼠脊髓損傷模型胃腸動力變化的研究,導(dǎo) 師：閆 軍 研 究 生：王德君 專 業(yè)：普通外科,目錄,一、研究背景二、研究內(nèi)容及其意義三、研究方案四、實驗特色與創(chuàng)新五、研究基礎(chǔ)與條件六、預(yù)期研究成果七、研究計劃八、經(jīng)費預(yù)算九、參考文獻,研究背景,近年來，隨著交通和建筑業(yè)的迅速發(fā)展，脊柱骨折合并脊髓損傷（Spinal cord

2、injury,SCI）已成為骨科領(lǐng)域中常見的疾患。據(jù)統(tǒng)計發(fā)達國家的SCI發(fā)病率為28.3-45人/百萬人/年，我國發(fā)病率雖較低，約6.7人/百萬年/年，但每年也有1萬余人遭此損傷，且以中青年胸腰段損傷最多。脊髓損傷治療困難，終身殘疾率較高，給社會和家庭帶來沉重的負擔(dān)。SCI后患者將要面對五項主要的問題：行走能力、大便控制、小便控制、性功能、疼痛，如何處理好這些問題仍是難題。近年來，國內(nèi)外對SCI后疼痛、行走能力的處理、尿動力等多方面的研

3、究較多，并取得一定的進展。與之相比，SCI后胃腸功能紊亂和排便功能障礙并沒有得到足夠的重視，而該問題會對患者的日常生活能力和回歸社會產(chǎn)生終身影響，給患者的生活、家庭及社會,研究背景,造成巨大的負擔(dān)。多項研究表明，在SCI穩(wěn)定以后，胃腸道功能紊亂可導(dǎo)致患者一系列的問題：獨立排便障礙、便秘、腹脹大便失禁、排便耗時明顯延長、飲食受限、戶外活動受限、精神壓力乃至影響壽命等。研究表明：胃腸運動是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、植物神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)源性腸神經(jīng)系統(tǒng)的參與

4、下進行的。其運動主要有中樞神經(jīng)系統(tǒng)來完成，植物神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)源性腸神經(jīng)系統(tǒng)起調(diào)整作用。這三部分任何一部分的異常都將導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。有“腸腦”之稱的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是胃腸調(diào)節(jié)機制中的決定性環(huán)節(jié)。腸神經(jīng)系統(tǒng)是由胃腸道、膽道及胰腺中所含的神經(jīng)節(jié)及其間的神經(jīng)纖維組成，控制著胃腸道的運動、分泌、血流及物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能，并把胃腸與中樞神經(jīng)系統(tǒng)及植物神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系起來。腸道內(nèi)神經(jīng)末梢釋放的化學(xué)物質(zhì)較為復(fù)雜，與運動有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)主要有血管,研究背景,活性腸肽、一氧

5、化氮、乙酰膽堿、P物質(zhì)等。而胃動素受體、生長抑素受體在腸神經(jīng)系統(tǒng)都有分布，提示胃動素和生長抑素的作用是通過神經(jīng)系統(tǒng)通路和對平滑肌的直接作用共同來完成的。研究表明，miR-31在維持神經(jīng)干細胞增殖中起著比較重要的作用。從而我們可以利用microRNA-31對脊髓損傷有修復(fù)作用來研究SCI后microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠胃腸動力變化與昆明小鼠胃腸動力變化的差異。研究SCI后的胃腸功能障礙對提高患者生活質(zhì)量、重返社會、延長壽命具有重要意義。

6、研究目的：利用microRNA對脊髓損傷有修復(fù)作用來研究SCI后microRNA轉(zhuǎn)基因小鼠胃腸動力變化與昆明小鼠胃腸動力變化的差異。,研究內(nèi)容及其意義,本研究的主要內(nèi)容是：1、脊髓損傷后胃腸動力的改變；2、影響胃腸動力的兩大主要激素：胃動素和生長抑素3、胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達研究SCI后的胃腸功能障礙對提高患者生活質(zhì)量、重返社會、延長壽命具有重要意義。,研究方案,實驗思考技術(shù)路線圖實驗

7、方法擬解決的關(guān)鍵技術(shù)問題,實驗思考,臨床——基礎(chǔ)研究——臨床microRNA-31 胃動素 脊髓損傷 和生長抑素 轉(zhuǎn)基因小鼠 的變化,,,,,隨機分組,技術(shù)路線圖,microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠,脊髓損傷,對照組,于第3d、7d、14d分別處死2只,,胃排空和小腸推進

8、率脊髓組織病理觀察、胃竇MTL-R1A 和結(jié)腸SSTR2 的mRNA的表達,,,,,,同前,,同前,昆明小鼠,,,,,脊髓損傷,對照組,,,于第3d、7d、14d分別處死2只,同前,,,胃排空和小腸推進率胃竇MTL-R1A 和結(jié)腸SSTR2 的mRNA的表達,同前,,,,造模,,,實驗方法,1 脊髓損傷模型的建立： 用脊髓打擊器建立脊髓損傷模型，采用BBB 評 分法，選擇BBB評分0分的小鼠為造模成功2

9、 小鼠的運動能力評定： 采用改良后CBS法進行動物運動行為評分，觀察 指標包括開放空間運動能力、腳趾伸展、觸地 反射、回縮反射、翻正反射、斜板試驗。并且 對小鼠雙后肢的運動功能觀察，采用BBB評分,3 分組： 取microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠和昆明小鼠各20雌雄不拘，將microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為兩組，其中對照組10只，脊髓損傷組10只，將昆明小鼠隨機分為兩組，其中對照組10只，脊髓

10、損傷組10只,（1）昆明小鼠脊髓損傷組：分別于脊髓損傷后第3d、7d、14d進行胃排空和小腸推進率檢測、脊髓組織病理觀察、RT-PCR法檢測胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達。（2）昆明小鼠對照組：分別于昆明小鼠造模組脊髓損傷后第3d、7d、14d進行胃排空和小腸推進率檢測、脊髓組織病理觀察、RT-PCR法檢測胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達。,（3）microRNA-31轉(zhuǎn)基因小

11、鼠脊髓損傷組：分別于脊髓損傷后第3d、7d、14d進行胃排空和小腸推進率檢測、脊髓組織病理觀察、RT-PCR法檢測胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達。（4）microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠對照組：分別于microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷后第3d、7d、14d進行胃排空和小腸推進率檢測、脊髓組織病理觀察、RT-PCR法檢測胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達。,,脊髓組織病理觀察：

12、 于造模后第3d、7d、14d,正常組和造模組各隨機抽取2只小鼠處死，以T11為中心取長約1.0cm的脊髓，以4%多聚甲醛固定24小時后，常規(guī)石蠟包埋，性HE染色，觀察脊髓組織形態(tài)學(xué)變化。,,胃排空和小腸推進率檢測：各組小鼠于造模后第7天，各組隨機抽取2只小鼠，每組灌服混有99m礙-二乙三胺五乙酸（99mTC-DTPA）0.05毫居（mCi）/10g和少量亞甲藍的營養(yǎng)性半固體糊標準餐20ml/kg胃內(nèi)核素殘留率（%）=（胃

13、內(nèi)核素殘留值/基準值）*100%小腸推進率（%）=（幽門括約肌至色素前端的距離（cm）/幽門括約肌至回盲部的距離（cm））*100%,,RT-PCR法檢測胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達： 造模后第3d、7d、14d，對照組和脊髓損傷組各隨機抽取2只小鼠處死，取1cm胃竇和結(jié)腸組織，用RT-PCR法檢測胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達,統(tǒng)計學(xué)方法：,計量資料多組間均值的比較

14、先采用單因素方差分析，方差齊時，以均值加減標準差（X±S）表示，組間的均值兩兩比較用SNK法（q檢驗）；自身前后均值比較采用配對t檢驗。以上數(shù)據(jù)由SPPS16.0完成統(tǒng)計，α=0.05,關(guān)鍵技術(shù),1、脊髓損傷模型的建立2、胃排空和小腸推進率檢測3、RT-PCR法檢測胃竇MTL-R1A mRNA和結(jié)腸SSTR2 mRNA的表達,本項目的特色與創(chuàng)新之處,本課題首次探討microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷后胃腸動力的變化,研

15、究基礎(chǔ)及條件,1.閆軍主任、王春芳教授具有豐富的科研和臨床經(jīng)驗。2.以查閱多篇國內(nèi)外相關(guān)文獻，并已基本掌握實驗所需各項操作技能。3.山西醫(yī)科大學(xué)王春芳教授實驗室完全滿足完成本實驗的條件。4.實驗室有專業(yè)的指導(dǎo)老師指導(dǎo)以保證課題的順利進行。5.相關(guān)的資金已經(jīng)到位,預(yù)期研究成果,預(yù)計microRNA-31轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓損傷后胃動素先下降后上升，生長抑素先上升后下降，昆明小鼠脊髓損傷后胃動素呈下降趨勢，生長抑素呈上升趨勢通過此研究

16、預(yù)計發(fā)表論文1-2篇。,研究計劃,2015年3月—2015年4月：查資料，寫綜述及開題報告。2015年4月—2015年6月：前期準備工作，實驗動物、耗材試劑購買，部分預(yù)試驗。2015年7月—2015年9月：動物實驗，分子生物學(xué)檢測。2015年10月—2015年12月：數(shù)據(jù)整理、論文書寫.,經(jīng)費預(yù)算,1、動物造模費用 5002、試劑及儀器使用費用 30003、耗材費用 100

17、04、出版費用 3000,參考文獻,Kelly SR，Shashidharan M，Borwell B，et al. The role of intestinal stoma in patients with spinal cord injury【J】.Spinal Cord，1999,37（3）：213-214.Han TR，Kim JH，Kwon BS. Chronic ga

18、strointestinal problems and bowl dysfunction in patients with spinal cord injury【J】. .Spinal Cord，1998,36（7）：485-490.,參考文獻,Steven AS，Susan BB，Lance LG. Neurogenic bowel dysfunction after spinal cord

19、injury ： clinical evalution and rehabilitative management【J】.Arch Phys Med Rehabil ，1997,78：S86-S102.Tatagiba M，Brosamle C，Schwab ME. Regeneration of injury axons in the adult mammalian central nerv

20、ous system. Neurlsurg，1997；40:541-547.,參考文獻,張三印，蕫宇，楊鵬.胃腸運動障礙發(fā)病機制與證治.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003；21（2）：209-211.陸英杰，連至誠.胃腸激素對胃腸動力的影響.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2005；5（6）：1338-1339.Zamore PD，Haley B. Ribo-gnome：the big world of small RNAs[J].Science

21、,2005,309(5740):15-19.,參考文獻,Banwell H, Greasey G. Management of neurogenic bowel in the petients with spinal cord injury[J]. Urol Clin N Am,1993,94(3):773-779.曹靜宜，周國昌.脊髓損傷患者的結(jié)腸通過時間測定【J】.中外民醫(yī)雜志.2001,2:1