雙水相萃取的原理及應(yīng)用分解

1、,雙水相萃取的原理及應(yīng)用,Aqueous two-phase extraction,2014210918 康文淵,,組員:,,NF-κB信號通路,劉文榮 王嘉犀 范倩 何亞玲,,英英釋義,,內(nèi)容 Content,1、雙水相萃取的歷史,2.雙水相萃取的基本原理,,,3.雙水相萃取的特點,4.雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的歷史：,,ATPE 的歷史：,Beijerinck （？？-）,早在1896年,Beijerinck

2、發(fā)現(xiàn),當明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時,得到一個混濁不透明的溶液，隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉), 這種現(xiàn)象被稱為聚合物的不相溶性，從而產(chǎn)生了雙水相體系(Aqueous two phase system,ATPS)。,,ATPE 的歷史：,,ATPE 的歷史：,1956年瑞典lund大學(xué)的Albertsson教授及其同事開始對雙水相系統(tǒng)進行比較系統(tǒng)研究。測定了許多雙水相系統(tǒng)的相圖，為雙水相萃取系統(tǒng)的發(fā)展奠定了

3、基礎(chǔ)。只局限于實驗室內(nèi)的測定和理論研究。,,ATPE 的歷史：,,ATPE 的歷史：,Kula教授研究小組對雙水相的應(yīng)用、工藝流程、操作參數(shù)、工程設(shè)備、成本分析等進行了大量研究，在應(yīng)用上獲得成功。1978年首先將雙水相萃取技術(shù)用于酶的大規(guī)模分離純化。,,ATPE 的歷史：,,ATPE 的歷史：,雙水相萃取可分離多肽、蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、細胞、細胞器、細胞組織，以及重金屬離子等，近年來，還應(yīng)用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效

4、成分等的分離純化。作為反應(yīng)系統(tǒng)用于酶反應(yīng)，生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵的產(chǎn)物生產(chǎn)與分離的集成。,,ATPE 的基本原理:,,ATPE 的基本原理,萃取：利用物質(zhì)在兩種互不混溶的溶劑中的分配差異進行分離的技術(shù)。 有機溶劑萃取：以與水互不相溶的有機溶劑作萃取劑從水相中萃取目的產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于抗生素、有機酸、維生素等發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)。用于蛋白質(zhì)、核酸、酶等生物大分子的分離很少成功。 反萃?。菏褂盟芤簭挠袡C溶劑中萃取水溶性的物質(zhì)。,,ATPE 的基本原

5、理:,,ATPE 的基本原理,反膠團萃?。豪帽砻婊钚詣┰谟袡C相中形成的反膠團（reversed micelles），從而在有機相內(nèi)形成分散的親水微環(huán)境。,,ATPE 的基本原理:,,ATPE 的基本原理,反膠團萃取：使生物分子在有機相（萃取相）內(nèi)存在于反膠團的親水微環(huán)境中，消除了生物分子，特別是蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)難于溶解在有機相中或在有機相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。 超臨界萃?。?,ATPE 的基本原理:,,ATPE 的基本原理,

6、以上方法對蛋白質(zhì)的分離純化有不同的缺陷。,,ATPE 的基本原理:,,ATPE 的基本原理,到目前為止，雙水相技術(shù)幾乎在所有的生物物質(zhì)如:氨基酸、多肽、核酸、細胞器、細胞膜、各類細胞、病毒等的分離純化中得到應(yīng)用, 特別是成功地應(yīng)用在蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離中。,,ATPE 的基本原理:,,ATPE 的基本原理,雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。,,ATPE 的基本原理:,,ATPE

7、的基本原理,當萃取體系的性質(zhì)不同時,物質(zhì)進入雙水相體系后,由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種作用力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等) 的存在和環(huán)境因素的影響,使其在上、下相中的濃度不同。,,,ATPE 的基本原理:,,ATPE 的基本原理,,,常用的雙水相體系:,,ATPE 的基本原理,高聚物/高聚物體系：聚乙二醇(簡稱PEG) / 葡聚糖(簡稱Dextran) 高聚物/無機鹽體系：硫酸鹽體系。常見的高聚物/ 無機鹽體系為: PEG/ 硫酸鹽或磷

8、酸鹽體系。,,常用的雙水相體系:,,ATPE 的基本原理,PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol),Kpi = 磷酸鉀,DX = 葡聚糖(dextran),,,,常用的雙水相體系:,,ATPE 的基本原理,PEG/Dx體系一般用于小規(guī)模地分離生物大分子、膜、細胞等，,PEG/無機鹽體系主要用來大規(guī)模地提純酶，這是因為PEG/無機鹽體系的萃取專一性更高，葡聚糖價格昂貴的緣故。,,ATPE 的基本原理,各種類型的雙水

9、相體系,,相圖:相平衡時物系的組成, 溫度與壓力的關(guān)系,,ATPE 的基本原理,,相圖:相平衡時物系的組成, 溫度與壓力的關(guān)系,,ATPE 的基本原理,雙節(jié)線(bi-nodal)：圖中的曲線。雙節(jié)線以下的區(qū)域為均相區(qū),以上的區(qū)域為兩相區(qū)，即ATPS 。 系線(tie line)：雙節(jié)線上連兩點的直線。K點：K點為臨界點，表示兩相差別消失。,,相圖:相平衡時物系的組成, 溫度與壓力的關(guān)系,,ATPE 的基本原理,系線反映的

10、信息 杠桿規(guī)則：系線上各點均為分成組成相同，而體積不同 的兩相。兩相體積近似服從杠桿規(guī)則 性質(zhì)差異：系線的長度是衡量兩相間相對差別的尺度, 系線越長,兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小.,,影響雙水相萃取的因素,,ATPE 的基本原理,,影響雙水相萃取的因素,,ATPE 的基本原理,聚合物分子量的影響： 對于給定的相系統(tǒng)，如果一種高聚物被低分子量的同種高聚物所代替，被萃取的大分子物質(zhì),如蛋

11、白質(zhì)、核酸、細胞粒子等，將有利于在低分子量高聚物一側(cè)分配。,,影響雙水相萃取的因素,,ATPE 的基本原理,聚合物分子量的影響： 如以Dextran 500(MW 500 000)代替Dextran 40（MW 40 000）,即增大下相高聚物的分子量，被萃取的低分子量物質(zhì)如細胞色素C分配系數(shù)增加并不顯著。然而，被萃取的大分子量物質(zhì)，如過氧化氫酶的分配系數(shù)可增大到原來的6~7倍。,,影響雙水相萃取的因素,,ATPE 的基本原理,pH

12、 值的影響：改變兩相的電位差 如體系pH值與蛋白質(zhì)的等電點相差越大， 則蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻。 pH值的變化也會影響磷酸鹽的離解程度，導(dǎo)致組成體系的物質(zhì)電性發(fā)生變化，也會使被分離物質(zhì)的電荷發(fā)生改變，從而影響分配的進行。,,影響雙水相萃取的因素,,ATPE 的基本原理,離子環(huán)境對蛋白質(zhì)在兩相體系分配的影響: 在雙水相聚合物系統(tǒng)中，加入電解質(zhì)時，其陰陽離子在兩相間會有不同的分配。 同

13、時，由于電中性的約束, 存在一穿過相界面的電勢差(Donnan電勢) ,它是影響荷電大分子，如蛋白質(zhì)和核酸等分配的主要因素。,,影響雙水相萃取的因素,,ATPE 的基本原理,例如，DNA萃取時，離子組分微小的變化可使DNA從一相幾乎完全轉(zhuǎn)移到另一相。,,,ATPE 的基本原理,離子液體BmimPF6直接萃取DNA,,,ATPE 的基本原理,基于離子液體BmimPF6的雙水相體系直接萃取牛血清蛋白。,,雙水相的特點,,ATPE 的特點,

14、對生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物、抗生素等的提取、純化方面的優(yōu)勢：(1)含水量高(70％~90％)，在接近生理環(huán)境的體系中進行萃取，避免生物活性物質(zhì)失活或變性。(2)可以直接從含有菌體的發(fā)酵液和培養(yǎng)液中提取所需的蛋白質(zhì)（或酶），可直接提取細胞內(nèi)酶，避免破碎或過濾等步驟。,,雙水相的特點,,ATPE 的基本原理,(3)分相時間短，自然分相時間一般為5min～15 min。(4)界面張力小(10-7～ 10-4mN／m)，利于兩相之間的質(zhì)量傳

15、遞。(5)不存在有機溶劑殘留問題，高聚物不易揮發(fā)，對人體無害。,,雙水相的特點,,ATPE 的基本原理,(6)大量雜質(zhì)可與固體物質(zhì)一同除去。(7)易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純工序可直接相連接，無需進行特殊處理。(8)操作條件溫和，在常溫常壓下進行。(9)親和雙水相萃取技術(shù)可以提高分配系數(shù)和萃取的選擇性。,,雙水相的特點,,ATPE 的基本原理,雖然該技術(shù)在應(yīng)用方面已經(jīng)取得了很大的進展，但幾乎都是建立在實驗的基礎(chǔ)上，到目前

16、為止還沒能完全清楚地從理論上解釋雙水相系統(tǒng)的形成機理以及生物分子在系統(tǒng)中的分配機理。,,雙水相的特點,,ATPE 的基本原理,不足之處:如易乳化、成相聚合物的成本較高、分離效率不高等,,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的基本原理,雙水相系統(tǒng)平衡時間短，含水量高，界面張力低，為生物活性物質(zhì)提供了溫和的分離環(huán)境。它還具備操作簡便、經(jīng)濟省時、易于放大。據(jù)報道，系統(tǒng)可從10ml直接放大到1m3規(guī)模（105倍）,而各種試驗參數(shù)均可按比例放大，產(chǎn)

17、物收率并不降低。,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的基本原理,英英釋義,,1、蛋白質(zhì)、酶的純化,2、多肽的分離純化,,3、核酸的分離純化,,4、其它分離純化,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的基本原理,主要是分離蛋白質(zhì) ，酶，病毒，脊髓病毒和線病毒的純化，核酸，DNA的分離，干擾素，細胞組織，抗生素，多糖，色素，抗體等。,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的基本原理,1) 蛋白質(zhì)、酶的純化2) 多肽的分離純化,,雙水相萃取的應(yīng)用,,A

18、TPE 的基本原理,目前，用此法來提純的酶已達數(shù)十種，其分離過程也達到相當規(guī)模，I-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4體系從Trichoderma koningii發(fā)酵液中分離純化β-木糖苷酶，該酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，純化倍數(shù)33。,,ATPE 的基本原理,以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:包括三步雙水相分離,第一步：所選擇的條件應(yīng)使蛋白質(zhì)產(chǎn)物分配在富PEG的上相中, 而細

19、胞碎片及雜質(zhì)蛋白質(zhì)等進入下相。,,ATPE 的基本原理,以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:包括三步雙水相分離,第二步：分相后上相中再加入鹽使再次形成雙水相體系,核酸和多糖則分配入富鹽的下相,雜質(zhì)、蛋白質(zhì)也進入下相,而所需的蛋白質(zhì)再次進入富含PEG的上相。,,ATPE 的基本原理,以蛋白質(zhì)的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:第三步：向分相后的上相中加入鹽以再一次形成雙水相體系。在這一步中,要使得蛋白質(zhì)進入富鹽的下相

20、,以與大量的PEG分開。蛋白質(zhì)與鹽及PEG的分離可以用超濾、層析、離心等技術(shù)。,,ATPE 的應(yīng)用,雙水相萃取的應(yīng)用,,,ATPE 的應(yīng)用,雙水相萃取的應(yīng)用,,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,3) 核酸的分離純化,,,ATPE 的應(yīng)用,4) 病毒、細胞器、細胞的分離,,,ATPE 的應(yīng)用,4) 病毒、細胞器、細胞的分離,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,5）中草藥成分的提取 甘草、銀杏液、黃芩苷等的有效成分分離。

21、 謝濤等利用 PEG 4000/ K2HPO4 組成的雙水相體系從三七中萃取三七皂苷,回收率為 96 %。,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,5）中草藥成分的提取( 1 )將 PEG和 K2HPO4 配成一定濃度的濃溶液; ( 2)在常溫下, 取三七濃縮液置于10ml的離心試管中, 加入一定體積的成相物質(zhì)濃溶液,振蕩搖勻,在離心機中以一定轉(zhuǎn)速離心 5min, 使其分相;,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,5）中草

22、藥成分的提取( 3 )分別讀取上下相體積, 并取樣分析上下相中三七總皂苷的含量。,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,5）中草藥成分的提取,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,5）中草藥成分的提取,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,5）中草藥成分的提取,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,6）雙水相萃取分析 黃毒苷的免疫測定,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,7）稀有金屬/貴金屬分離 克

23、服溶劑萃取法的不足。 在聚乙二醇 2000/硫酸按/偶氮胂（shen四聲） ( Ⅲ)雙水相體系中 ,實現(xiàn)了 Ti ( Ⅳ)與 Zr（鋯gao） ( Ⅳ)的分離,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,7）稀有金屬/貴金屬分離 分別在 60 ml 分液漏斗中加入不同 pH 值的緩沖溶液 2 ml , 偶氮胂 Ⅲ 溶液 0. 6 ml , PEG 溶液 5ml和一定量的金 屬離子溶液 , 用 水定容到 10ml , 再加入 2g 固體

24、(NH4) 2SO 4, 振蕩 3 ～5min , 靜置 , 待兩相分層清楚后 , 將下層水相放入 25ml 比色管中 , 測定金屬離子在下層水相中的殘留量 , 從而計算萃取率 。,,雙水相萃取的應(yīng)用,,ATPE 的應(yīng)用,7）稀有金屬/貴金屬分離,,雙水相萃取的發(fā)展,,ATPE 的發(fā)展,1）開發(fā)廉價雙水相體系 2）將雙水相同其它分離技術(shù)相結(jié)合，從而提高分離效率，使雙水相萃取技術(shù)能夠有更高的生命活力！,,雙水相萃取的發(fā)展,,ATP

25、E 的發(fā)展,兩種雙水相體系的比較,,雙水相萃取的發(fā)展,,ATPE 的發(fā)展,變性淀粉PPT-PEG體系已被用來從發(fā)酵液中分離過氧化氫酶，β-半乳糖苷酶等。①蛋白溶解度大。②粘度小。③價格便宜。,,雙水相萃取的發(fā)展,,ATPE 的發(fā)展,(1) 與溫度誘導(dǎo)相分離、磁場作用、超聲波作用、氣溶膠技術(shù)等實現(xiàn)集成化,改善了雙水相分配技術(shù)中諸如成相聚合物回收困難、相分離時間較長、易乳化等問題,為雙水相分配技術(shù)的進一步成熟、完善并走向工業(yè)化奠定了基