豬血漿白蛋白的雙水相萃取、純化及鑒定.pdf

1、生豬在屠宰過程中會產(chǎn)生大量的豬血副產(chǎn)物，目前豬血的開發(fā)利用主要是以全血為原料應用于食品及飼料工業(yè)中，產(chǎn)品附加值較低，尤其對于血液中具有功能活性的蛋白利用率更加不足，這取決于血液中蛋白的常規(guī)提取方法如:冷乙醇沉淀法、鹽析法、色譜法等存在成本高昂、回收率低、對生產(chǎn)設備和環(huán)境要求高、分離操作方法過于繁瑣等問題，造成蛋白制備工藝復雜。針對這些問題，本文以豬血為原料，采用雙水相萃取分離技術，提取豬血中的功能性質(zhì)白蛋白，考察不同因素對白蛋白在雙水相

2、體系中分配系數(shù)和回收率的影響。通過對雙水相法提取的豬血漿白蛋白進行結(jié)構及性質(zhì)鑒定，并用柱層析法進行了進一步的純化。本文主要的結(jié)論如下:
　　1、通過雙水相體系相圖的繪制，確定選用乙醇/磷酸氫二鉀體系來提取豬血漿白蛋白，并考察乙醇濃度、磷酸氫二鉀濃度、蛋白處理量等因素對雙水相體系分離白蛋白的影響。通過響應面實驗，得到雙水相體系中白蛋白的分配系數(shù)與回收率的二元多次回歸方程。當乙醇濃度為15％(W/W)、磷酸氫二鉀濃度為23％(W/W)

3、、蛋白初始濃度為24 mg/mL時，白蛋白的分配系數(shù)和回收率分別為15.71和96.75％。
　　2、采用上述雙水相體系制備的樣品中蛋白含量為97.35％，與標準白蛋白相比，樣品蛋白在紫外光譜290.8 nm下具有最大吸收峰。SDS-PAGE結(jié)果表明:該蛋白樣品中存在亞基組分為66 kDa的白蛋白以及50 kDa與27 kDa的免疫球蛋白的重鏈與輕鏈。紅外光譜掃描圖顯示:樣品蛋白保留了標準白蛋白在1649.45 cm-1與1532

4、.65 cm-1處的酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅱ帶特征峰，但是在1075.55 cm-1波數(shù)下出現(xiàn)了C=O基團的特征峰，可能是形成了白蛋白聚集體。圓二色譜結(jié)果表明:樣品蛋白在208 nm和222 nm出現(xiàn)了同樣的特征峰，但222 nm色譜峰強度減弱，說明α-螺旋結(jié)構有輕微的破壞，樣品蛋白的變性溫度為61.1℃。在不同pH下對樣品的溶解性、起泡性和乳化性的測定表明其在pH=4和pH=8處均出現(xiàn)兩個極低值，說明所得白蛋白樣品中可能混有部分免疫球蛋白。<

5、br>　　3、為了進一步提純雙水相萃取的白蛋白，采用苯基-瓊脂糖凝膠對其進行進一步純化，考察平衡液pH、所含鹽種類及鹽含量對洗脫效果的影響。在pH為7的磷酸鹽緩沖液中添加0.8 mol/L的磷酸氫二鉀，洗脫體積為18～24 mL時，洗脫效果最佳。與雙水相法提取的白蛋白相比，純化后的白蛋白SDS-PAGE圖譜表明樣品蛋白中含有亞基為66 kDa的白蛋白，50 kDa與27 kDa的免疫球蛋白重鏈與輕鏈特征條帶得到有效去除，紫外光譜掃描表明