pcr的臨床應(yīng)用醫(yī)院發(fā)

1、臨床基因擴增技術(shù)的應(yīng)用,四川省臨床檢驗中心 杜 瓊 2012、03,基因擴增技術(shù)的應(yīng)用,該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用近30年—成熟應(yīng)用十分廣泛-工、農(nóng)、法、考古、醫(yī)學(xué)。,在臨床方面的應(yīng)用,內(nèi)源基因的檢測-體內(nèi)（易感基因） 外源性基因的檢測-體外侵入（耐藥基因）基因配型的檢

2、測-相似程度（親子鑒定）,如何利用好PCR技術(shù)？,熟悉PCR技術(shù)的基本原理認識PCR技術(shù)的特點 各種檢測項目的價值了解PCR技術(shù)的影響因素理解檢測結(jié)果的臨床意義,基本原理,以DNA為例（1）DNA變性：（2）降溫退火：（3）引物延伸：,原理 第一步 – 加熱變性,預(yù)處理,第二步 – 引物與靶序列退火,,第三步 - 引物延伸,第1個 PCR 循環(huán)完成后 – 得到兩個拷貝的靶序列,30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量

3、,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,熒光PCR的原理,PCR技術(shù)的特點,靈敏度高 特異性強 快速簡便 應(yīng)用范圍廣,臨床應(yīng)用,肝炎病毒優(yōu)生優(yōu)育性病病原體呼吸道病原體其他病原體,HBV的Dane顆粒形態(tài)（完整的病毒，具有傳染性）,HBsAg,HBc

4、Ag,HBV DNA,DNAP,,,,,,,,（外膜蛋白）,（核衣殼蛋白）,,肝炎病原體檢測的意義,HBV、HCV1、了解肝炎病毒在體內(nèi)存在的數(shù)量。 傳染？復(fù)制？治療？2、肝功能異常是否由肝炎病毒引起？早 期診斷（窗口期）的感染者。3、基因分型可選抗病毒藥物 。,,4、判斷藥物治療的效果。5、進行HBV分子流行病學(xué)研究。,傳統(tǒng)檢測乙肝、丙肝病毒的指標,抗原或者抗體：兩對半、前S1、S2、HCV抗原、抗體。肝功

5、能其他指標,HBV基因型的特征,B型 C型流行性 低 高HBeAg陽性率 低 高 HBeAg自然清除時間 短 長 HBV DNA 載量

6、 低 高致病性 輕 重HCC發(fā)生率 低（低年齡組高） 高（高年齡組高）干擾素治療完全應(yīng)答率 高 低抗病毒治療效果 高 低肝癌手術(shù)治療預(yù)后

7、 好 差 癌栓栓塞治療效果 好 差,優(yōu)生優(yōu)育指標,HCMV、TOX、RV、HSVI、HSVII孕期感染ToRCH病原體后，一般以隱性感染為主，無明顯癥狀，不易識別。引起胎兒感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)或胎兒生長遲緩、畸形。,,ToRCH抗體的檢測：不能分辨感染時間。不能作為終止妊娠的指標。無法

8、進行早期診斷。,性病病原體,CT、UU、NGH、 HPV、 TP 人乳頭瘤病毒分型（HPV） 人乳頭瘤病毒6、11型—尖銳濕疣 人乳頭瘤病毒高危型--宮頸癌 梅毒螺旋體（TP）,,CT、UU、NGH、 HPV、 TP除NGH可培養(yǎng)外，其余難培養(yǎng)或者不能培養(yǎng)。即使能培養(yǎng)，所需時間長—48小時↑。,看看這些英年早逝的藝人，她們死于宮頸癌……宮頸癌的知曉率在不斷提高。,梅艷芳(40歲),國家一級演員李媛媛(41歲),呼吸

9、道病原體的檢測,TB、MP、CP、SARS、H1N1TB-DNA 可以對結(jié)核病人早期診斷 可以鑒別診斷肺結(jié)核和肺癌 結(jié)核與其他分枝桿菌區(qū)分 對含菌量低的標本的分離,,TB：抗體--TB：培養(yǎng)—幾天報陰TB：涂片陽性↓↓MP、CP：無法培養(yǎng)MP、CP：抗原抗體檢測—交叉反應(yīng),其他病原體的檢測,EB、HP、EV71、EV、Cox A16EB：在人群中廣泛感染，主要通、過唾液傳播，也可經(jīng)輸血傳染。 青年期發(fā)

10、生原發(fā)感染，約有50%出現(xiàn)傳染性單核細胞增多癥，發(fā)熱、咽炎和頸淋巴結(jié)腫大。,,40歲以上中老年人檢測出與鼻咽癌關(guān)系 密切 。 慢性疲勞綜合癥有關(guān),不合格標本帶來的后果,,,,,檢驗結(jié)果解析,HBV--DNA定量結(jié)果定量測定，測定的是病毒量的“多”或“少”；結(jié)果報告方式：>多少？，<多少？具體值？,舉例,例如：試劑盒檢測范圍是103—108IU/ml,我們測定的陰性結(jié)果應(yīng)報告＜ 103 IU/ml；（無、含量

11、低）。中間值報告具體數(shù)據(jù)；當含量高于最高檢測限時，報告＞108 IU/ml。（ 108 IU/ml； 109 IU/ml …..） 參考范圍?,,IU/ml與COP/mlD的換算---咨詢廠家 3.5E+05 IU/ml----表示一毫升血清中有350，000個HBV病毒微粒。,HBV—DNA的變化,在患者治療過程中檢測HBV—DNA定量，一般認為：其結(jié)果相差5倍屬正常波動，結(jié)果相差降低10倍以上才算治療有效。,例如1,有

12、一患者治療前檢測HBV-DNA定量為8.8E+06 IU/ml，治療一月后復(fù)查為2.3E+07 IU/ml，兩結(jié)果相差2.6倍。（不一定是高了？）如何向病人解釋：屬正常波動或者檢測誤差（允許誤差）,例如2,一患者治療前檢測HBV-DNA定量為9.2E+06 IU/ml；治療一月后復(fù)查為2.8E+06 IU/ml，兩結(jié)果相差3.3倍，不能說明治療有效，需要繼續(xù)觀察。要有明顯的下降趨勢。,PCR技術(shù)的新認識,PCR 技術(shù)

13、誕生以來，應(yīng)用廣泛，同時不斷發(fā)展與完善，解決了以往PCR 的瓶頸問題：靈敏度、假陽性。 防污染問題：假陽性的解決。它將作為常規(guī)檢驗方法進行全面普及，發(fā)揮積極的作用。,嚴格管理,作為二類醫(yī)療技術(shù)的管理--技術(shù)準入實驗室技術(shù)人員的上崗培訓(xùn)質(zhì)量體系文件的建立實驗室的標準化設(shè)置檢測試劑的審批,,臨床基因擴增實驗室平面圖,標本接收區(qū),試劑準備區(qū),核酸提取區(qū),核酸擴增區(qū),產(chǎn)物分析區(qū),專用通道,緩沖區(qū),緩沖區(qū),,,,,質(zhì)