IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、喹諾酮類藥物是目前應(yīng)用非常廣泛的廣譜抗生素之一，細(xì)菌對該類藥物的耐藥性備受關(guān)注。介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥的機(jī)制包括染色體基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥。其中，qnr基因是近年來的研究熱點(diǎn)，qnr基因型包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrS，本地區(qū)以qnrB型多見。qnrB存在于ISCR1（Insertion Sequence Common Regions1，插入序列共同區(qū)1)可變區(qū)內(nèi)，與ISCR1相連介導(dǎo)耐藥傳播。而ISCR1通常與I類

2、整合子結(jié)合，組成復(fù)合性I類整合子。由于同時含有I類整合子和 ISCR1兩種基因轉(zhuǎn)移元件，因此，復(fù)合性 I類整合子具有對耐藥基因更強(qiáng)大的傳播能力。對整合子、qnr基因等的檢測，以往的方法主要有：PCR-RFLP、脈沖凝膠電泳技術(shù)、Southern Blot技術(shù)等，這些方法繁瑣，耗時耗力，因此建立一種快速簡便的檢測IntI-ISCR1-qnrB的方法十分必要。
　　鑒于此，本研究通過調(diào)查研究199例臨床分離株，首先建立一種可快速檢測I

3、類整合子、ISCR1和喹諾酮耐藥基因qnrB的IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法,并對該方法的特異性和靈敏度進(jìn)行評價。在此基礎(chǔ)上，利用所建立的IntI-ISCR1-qnrB方法檢測臨床分離株，通過與藥敏試驗(yàn)方法比較，分析方法的臨床應(yīng)用價值，為喹諾酮類耐藥提供臨床預(yù)警信息。
　　方法
　　1．菌株來源：199例革蘭陰性桿菌菌株分離自2014年11月9日至2014年5月5日期間某院臨床各科室送檢標(biāo)本。
　　2．微

4、生物鑒定和藥敏系統(tǒng)對所有臨床分離株進(jìn)行鑒定和藥敏分析。
　　3．采用Primer Premier5.0軟件，以I類整合酶基因、ISCR1保守區(qū)orf513、qnrB基因保守區(qū)為靶區(qū)分別設(shè)計(jì)特異性的引物，構(gòu)建IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法反應(yīng)體系。
　　4．梯度PCR法確定IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法的最適退火溫度。
　　5．IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法同時檢測I類整合子、I

5、SCR1、qnrB耐藥基因，瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以Image J軟件掃描電泳條帶灰度值，對目的基因進(jìn)行半定量分析。
　　6．IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法檢測80例臨床分離菌株，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，評價建立的IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法的特異性。
　　7．麥?zhǔn)媳葷岱z測細(xì)菌濃度，將細(xì)菌原始濃度稀釋成108cfu/ml，并依次倍比稀釋為107、106、105、104、103、10

6、2、101cfu/ml，用IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,分析該方法的靈敏度。
　　8．以IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法檢測119例臨床分離株，并與藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較。
　　9．采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法之間的差異比較用?2檢驗(yàn)，α=0.05。
　　結(jié)果
　　1．梯度PCR法確定 IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法的最適退火溫度為57.5℃。<

7、br>　　2．IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法同時檢測到I類整合子、ISCR1、qnrB三個基因，產(chǎn)物分別是280bp、475bp、607bp，與目標(biāo)靶序列一致。
　　3．IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法檢測80例臨床分離菌株，IntI-ISCR1-qnrB陽性19例，平均OD值分別為IntI217.9±33.3，ISCR1243.2±60.6，qnrB203.7±59.4. IntI-ISCR1-qnrB

8、陰性61例。測序分析IntI-ISCR1-qnrB陽性的為19例，符合率100％，測序結(jié)果經(jīng)Blast證實(shí)與GeneBank公布序列一致，序列號分別是：HQ018645.1，KM111273.1，NG036203.1。
　　4．IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法靈敏度為101cfu/ml。
　　5．IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法檢測119例臨床分離菌株IntI-ISCR1-qnrB基因，IntI-IS

9、CR1-qnrB陽性35例，IntI-ISCR1-qnrB陰性84例。藥敏試驗(yàn)喹諾酮耐藥92例，敏感及中介27例。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測χ2=3.36<χ2（0.05,1）=3.84, P>0.05，所建立的IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法與藥敏試驗(yàn)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　1．成功建立了能夠一次PCR同時檢測I類整合子、ISCR1、qnrB耐藥基因三個靶標(biāo)的IntI-ISCR1-qnrB多重PCR方法，該