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文檔簡介
1、核酸類藥物分析,第一節(jié) 概 述第二節(jié) 分析方法第三節(jié) 應(yīng)用實例,第一節(jié) 概 述,一、結(jié)構(gòu)與分類核酸類藥物可以通過幫助恢復(fù)正常代謝或干擾某些異常代謝來達到治療疾病的目的。核酸是由多個單核苷酸通過3′,5′磷酸二酯鍵聚合而成的生物大分子,單核苷酸的基本結(jié)構(gòu)包括核苷和磷酸,核苷是含氮堿基(嘌呤堿與嘧啶堿) 與戊糖通過糖苷鍵縮合而成。根據(jù)戊糖的種類可將核酸分為核糖核酸和脫氧核糖核酸。,核酸、核苷酸類藥物是指具有藥用價
2、值的核酸、核苷酸、核苷和堿基以及它們的類似物或衍生物。按照化學結(jié)構(gòu)和組成可分成四類:①核酸堿基及其衍生物,如硫鳥嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韋等;②核苷及其衍生物,如肌苷、利巴韋林、阿糖胞苷;③核苷酸及其衍生物,如三磷酸腺苷二鈉、胞磷膽堿鈉、環(huán)磷腺苷;④多核苷酸,如寡聚核苷酸、核糖核酸Ⅰ、核糖核酸Ⅱ、抗腫瘤免疫核糖核酸等。,阿昔洛韋其化學名為9-(2-羥乙氧甲基)鳥嘌呤?;瘜W結(jié)構(gòu)式:藥理作用: 抗病毒藥。體外對單純性皰疹病
3、毒、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒等具抑制作用?! 、俑蓴_病毒DNA多聚酶,抑制病毒的復(fù)制; ②在DNA多聚酶作用下,與增長的DNA鏈結(jié)合,引起DNA鏈的延伸中斷。本品對病毒有特殊的親和力,但對哺乳動物宿主細胞毒性低。,二、理化性質(zhì)1溶解性 多核苷酸、核苷酸類藥物均為磷酸鹽,除環(huán)磷腺苷外,在水中均易溶。 核苷類藥物在乙醇、乙醚等有機溶劑中的溶解度均較差,部分核苷類藥物在水中
4、易溶(如利巴韋林),部分核苷類藥物在水中微溶(如肌苷)。核酸堿基類藥物大多能溶于酸性或堿性溶劑,如氟胞嘧啶,在稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液中易溶。,2紫外吸收 核苷酸的磷酸酯和戊糖均沒有明顯的紫外吸收,而嘌呤堿和嘧啶堿等堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu),在紫外光區(qū)有明顯吸收。因此多核苷酸、核苷酸和核苷與構(gòu)成它們的堿基具有相似的紫外吸收光譜,最大吸收波長一般在260nm附近。3酸堿性 核苷酸分子結(jié)構(gòu)中的
5、磷酸和戊糖均呈酸性,其中磷酸酸性較強,堿基為含氮化合物呈弱堿性,故多核苷酸、核苷酸類和核苷類藥物均為兩性化合物。核酸堿基類藥物只有堿基,呈堿性。4水解性 核苷酸類藥物分子結(jié)構(gòu)中磷酸與戊糖間的酯鍵和戊糖與堿基間的糖苷鍵都會發(fā)生水解,同樣條件下酯鍵先水解。,第二節(jié) 分析方法,各種核酸類藥物都含有堿基,都具有弱堿性和紫外吸收性質(zhì); 多核苷酸、核苷酸、核苷類藥物中均含有戊糖; 多核苷酸和核苷酸結(jié)構(gòu)
6、中都含有磷酸。 因此它們有一些共同的分析方法,如用紫外分光光度法進行鑒別或含量測定。,一、鑒別(一)化學鑒別1戊糖的鑒別(1)地衣酚反應(yīng) 核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷與酸共熱時,水解形成的戊糖基脫水變?yōu)榭啡倥c3,5二羥基甲苯(地衣酚) 反應(yīng),縮合生成綠色化合物。用三價鐵鹽或銅鹽作催化劑,可增加呈色的靈敏度。地衣酚反應(yīng)特異性較差,凡戊糖均有此反應(yīng)。,綠色 670nm,,(2)二苯胺反應(yīng)
7、 脫氧核糖核酸、脫氧核苷酸或脫氧核苷與酸共熱水解產(chǎn)生的脫氧核糖在乙醛存在下與二苯胺反應(yīng),生成藍色化合物,在595nm波長處有最大吸收。 核糖核酸、核糖核苷酸無此反應(yīng)。,藍色 595nm,2磷酸鹽的鑒別 核酸、核苷酸類藥物在酸性條件下加熱水解產(chǎn)生的磷酸與過量的鉬酸銨[(NH4)3MoO4]反應(yīng),生成磷鉬酸銨放冷析出黃色沉淀。此反應(yīng)為磷酸鹽的一般鑒別試驗。 3嘌呤堿的鑒別 含有
8、嘌呤堿的核酸類藥物在水溶液中可與氨制硝酸銀試液反應(yīng),生成白色的銀鹽,遇光變?yōu)榧t棕色。此反應(yīng)為嘌呤堿的特征鑒別反應(yīng)。,4氟元素的鑒別 氟尿嘧啶、氟胞嘧啶等含氟有機化合物遇強氧化劑如三氧化鉻的飽和硫酸溶液時,在微熱條件下會產(chǎn)生氟化氫,腐蝕玻璃表面造成硫酸溶液不能均勻涂于管壁,產(chǎn)生類似油垢的現(xiàn)象。 5硫元素的鑒別 硫鳥嘌呤分子結(jié)構(gòu)中的S元素在甲醇鈉溶液中緩緩加熱后會轉(zhuǎn)化成硫化氫氣體,使醋酸鉛試紙顯黑色
9、或灰色。巰嘌呤分子結(jié)構(gòu)中的巰基還可與醋酸鉛試液反應(yīng)生成黃色沉淀。,(二)光譜鑒別1. 紫外吸收光譜法 堿基結(jié)構(gòu)中的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)在紫外光區(qū)具有特征吸收,可用于鑒別。 如吸收系數(shù)、最大吸收波長及其固定濃度下的吸光度、最小吸收波長等。,2紅外吸收光譜法 紅外吸收光譜法主要分為標準圖譜對照法或?qū)φ掌穼φ辗ǎ吨袊幍洹分饕捎脴藴蕡D譜對照法。 紅外光譜具
10、有疊加性,共存組分會使待測組分的紅外光譜圖發(fā)生變化,因此紅外吸收光譜法一般用于純度較高的原料藥的鑒別。 影響紅外吸收光譜的因素較多: 如試樣的制備方法、水分、晶型等,因此鑒別時應(yīng)嚴格按規(guī)定繪制圖譜。對于可能發(fā)生轉(zhuǎn)晶的藥物,需按規(guī)定重結(jié)晶后再繪制圖譜,如更昔洛韋的鑒別,本品的紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照品的圖譜一致,如不一致,取本品和對照品適量,分別加水制成飽和溶液,濾過,取濾液在10℃以下放置過夜,待析出結(jié)
11、晶,濾過,濾渣經(jīng)105℃干燥后,再次測定。,二、檢查 核糖核酸、脫氧核苷酸鈉多采用提取法制備,寡聚核苷酸多采用化學合成法,核酸堿基、核苷、核苷酸類藥物大多采用酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備。 核酸類藥物的雜質(zhì)檢查包括一般雜質(zhì)檢查、特殊雜質(zhì)檢查和安全性檢查。 一般雜質(zhì)檢查主要有氯化物、硫酸鹽、重金屬、砷鹽、銨鹽、鐵鹽、干燥失重、熾灼殘渣等,安全性檢查主要有細菌內(nèi)毒素
12、、異常毒性、無菌檢查等,重點介紹從原料中帶入或在生產(chǎn)過程中引入的雜質(zhì)、污染物或其他成分等特殊雜質(zhì)。,(一)多核苷酸類藥物的檢查1吸光度 核糖核酸、脫氧核苷酸鈉多采用提取法從細胞或動物內(nèi)臟制得,如核糖核酸Ⅰ系由健康豬的肝臟提取制得。制備過程中不可避免會帶入一定的蛋白質(zhì),吸光度檢查即為了控制核酸類藥物中蛋白質(zhì)的含量。具體方法是配制一定濃度的供試液,分別在260nm與280nm的波長處測定吸光度,要求該吸光度比
13、值應(yīng)不得低于1.7。 純RNA在260nm和280nm波長處的吸光度比值在2.0以上,DNA的吸光度比值為1.9左右;當樣品中蛋白質(zhì)含量增加時該比值會下降。,,2核糖核酸中脫氧核糖核酸的檢查 檢查原理:脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性條件下與二苯胺反應(yīng)會生成藍色化合物,在600nm附近有最大吸收,而核糖核酸無此反應(yīng)。通過控制600nm處的吸光度,即可控制脫氧核糖核酸的含量。,,3增色效應(yīng)
14、 核酸分子解鏈變性或斷鏈時,其發(fā)色基團———堿基暴露后,會造成紫外吸收增強的現(xiàn)象。但其他的雜質(zhì),如蛋白質(zhì)也具有增色效應(yīng),故通過要求增色效應(yīng)不得低于某個數(shù)值,可以控制相關(guān)雜質(zhì)。如核糖核酸Ⅰ要求本品的增色效應(yīng)大于30%.,(二)核苷酸、核苷、核酸堿基類藥物的檢查1有關(guān)物質(zhì) 結(jié)構(gòu)相似的其他非目標化合物,即有關(guān)物質(zhì)。以硫鳥嘌呤中“有關(guān)物質(zhì)”檢查為例進行說明。硫鳥嘌呤是以鳥嘌呤為原料制備而得,終產(chǎn)品中可能帶入殘留的原料、
15、中間體、副反應(yīng)產(chǎn)物等結(jié)構(gòu)與硫鳥嘌呤類似的雜質(zhì),統(tǒng)稱為“有關(guān)物質(zhì)”。該類雜質(zhì)中,鳥嘌呤是已知雜質(zhì)且有對照品,采用對照品對照法進行檢查;其他雜質(zhì)則采用不加校正因子的主成分自身對照法進行檢查。,2含氯量 鹽酸阿糖胞苷的生產(chǎn)過程中可能會因成鹽不完全或產(chǎn)生一些其他的鹽酸鹽雜質(zhì),造成藥物中鹽酸的含量發(fā)生變化,即氯含量發(fā)生變化。因此通過含氯量測定可控制其純度。3含氟量 氟尿嘧啶原料藥中氟化程度也可通過含氟量來進行控制。,三、含量測定
16、 核酸類藥物結(jié)構(gòu)中的嘧啶堿和嘌呤堿,具有一定的弱堿性,可采用非水堿量法進行含量測定; 其共軛結(jié)構(gòu)具有一定的紫外吸收,可通過測定最大吸收波長的吸光度來測定含量,也可用帶紫外檢測器的HPLC法定量。 核酸類原料藥的雜質(zhì)較少時,可用非水堿量法或紫外分光光度法定量;雜質(zhì)較多時則需采用具有分離、分析能力的高效液相色譜法。,(一)非水堿量法1原理
17、 核苷或堿基衍生物、類似物等藥物的堿性較弱,在水溶液中用酸滴定時沒有明顯的突躍,難以獲得滿意的測定結(jié)果。而在冰醋酸溶劑中,弱堿性基團的相對堿強度得到顯著增加,可被高氯酸滴定液定量滴定,根據(jù)消耗的高氯酸滴定液體積即可計算該類藥物的含量。 以更昔洛韋的含量測定為例:取本品約0.15g,精密稱定,加冰醋酸40ml,加熱使溶解,放冷,加結(jié)晶紫指示液1滴,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液顯綠色,并將滴定
18、結(jié)果用空白試驗校正。每1ml的高氯酸滴定液(0.1mol/L)相當于25.52mg的C9H13N5O4。,2注意事項 該方法準確度高、精密度好,在具弱堿性原料藥的含量測定中應(yīng)用廣泛。但該方法受到的影響因素較多,必須注意以下問題。(1)水分在冰醋酸中呈堿性,可與高氯酸反應(yīng),所以反應(yīng)體系中不應(yīng)有水分。(2)由于所用溶劑———冰醋酸有揮發(fā)性且膨脹系數(shù)較大,高氯酸滴定液的濃度受溫度和貯存條件影響很大。滴定時與標定時
19、的溫度差對高氯酸滴定液濃度的影響很大,一般溫度差小于10℃時,滴定液的濃度經(jīng)校正后即可用于定量計算;若溫度差超過10℃,則應(yīng)重新標定滴定液的濃度。高氯酸滴定液的濃度校正公式如下:,,(3)冰醋酸溶劑的揮發(fā)、弱堿性雜質(zhì)的存在都可能對測定結(jié)果造成干擾,故該法必須進行空白校正,即不加供試品,同法操作,所得結(jié)果應(yīng)扣除空白。(4)常用電位滴定法和指示劑法作為終點的指示方法,但指示劑的終點顏色變化需用電位滴定法確定。,(二)紫外分光光
20、度法 嘌呤堿基和嘧啶堿基的紫外吸收特征除了可用于鑒別外,還可用于該類藥物的含量測定。 《中國藥典》(2015年版) 收載的巰嘌呤、氟尿嘧啶和別嘌醇的原料藥均采用紫外分光光度法中的吸收系數(shù)法進行含量測定。(三)高效液相色譜法 大多數(shù)核酸類藥物可用常規(guī)的反相高效液相色譜法進行分離測定,但部分結(jié)構(gòu)中存在極性基團的核酸類藥物采用常規(guī)方法分離時,效果較差,需改用一些
21、特殊的高效液相色譜法,如離子對色譜法或離子交換色譜法。,1離子對色譜法 核苷酸類藥物的磷酸基在反相高效液相色譜條件下經(jīng)常以離子化狀態(tài)存在,保留很弱,不利于分離和測定。 離子對高效液相色譜法可以有效改善核苷酸的色譜保留,實現(xiàn)準確定量。 《中國藥典》(2015年版) 收載的環(huán)磷腺苷、三磷酸腺苷二鈉和胞磷膽堿鈉均采用離子對色譜法進行含量測定。 離
22、子對色譜法是在流動相中加入適量的反離子,使其與呈解離狀態(tài)的待測組分形成離子對,增加其在非極性固定相上的分配,從而改善其色譜保留與分離行為。 核苷酸為酸性物質(zhì),故其離子對試劑常用季銨鹽陽離子試劑,如四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨。離子對色譜的影響因素較多,包括反離子的性質(zhì)和濃度、流動相的組成、pH值和離子強度等,需仔細選擇。,環(huán)磷腺苷的含量測定: 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以
23、磷酸二氫鉀與四丁基溴化銨的混合溶液 為流動相;檢測波長為258nm。 取環(huán)磷腺苷對照品約10mg,加水5ml使溶解,加1mol/L的鹽酸溶液1ml,水浴加熱30min后冷卻,用氫氧化鈉試液調(diào)至中性,用水稀釋制成每1ml中約含0.2mg 的溶液,?。玻唉蹋熳⑷胍合嗌V儀,環(huán)磷腺苷峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求,理論板數(shù)按環(huán)磷腺苷峰計算不得低于2000,拖尾因子應(yīng)小于1.4。,2離子交換色譜法 核酸類藥物
24、結(jié)構(gòu)中有含氮堿性基團、多羥基糖苷,有些還以磷酸鹽形式存在,這些基團會與常規(guī)的C18色譜柱上的殘留硅醇羥基發(fā)生氫鍵吸附,造成峰形拖尾和柱壓升高,不利于分離測定。利用該類藥物在適當條件下可發(fā)生離子化的性質(zhì),改用離子交換樹脂(如磺化交聯(lián)的苯乙烯-二乙烯基共聚物) 作為固定相填料,通過離子交換原理進行分離,可以有效改善拖尾的問題。 《中國藥典》從2005年版開始改用陽離子交換色譜法對利巴韋林進行含量測定,結(jié)果有
25、明顯改善。,利巴韋林的含量測定。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用磺化交聯(lián)的苯乙烯-二乙烯基共聚物的氫型陽離子交換樹脂為填充劑;以水(用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1) 為流動相;檢測波長為207nm。理論板數(shù)按利巴韋林峰計算不低于2000。離子交換色譜常使用水緩沖溶液作流動相,有時也通過加入適量有機溶劑如甲醇或乙醇來提高分離度或改善樣品的溶解度。,第三節(jié) 應(yīng)用實例,一、巰嘌呤 巰嘌呤
26、為次黃嘌呤類似物,通過抑制核酸合成而發(fā)揮抗腫瘤作用。藥用為含一個結(jié)晶水的巰嘌呤。本品主要經(jīng)化學合成法制備。 巰嘌呤主要以氰乙酸乙酯為原料進行合成。在加熱的無水乙醇與乙醇鈉溶液中,氰乙酸乙酯先與硫脲環(huán)合生成2-巰基-4-氨基-6-羥基嘧啶,經(jīng)亞硝基化、還原得2-巰基-4,5-二氨基-6-羥基嘧啶,然后在活性鎳的作用下,消除巰基得4,5-二氨基-6-羥基嘧啶,進一步與甲酸環(huán)合成6-羥基嘌呤,然后在吡啶溶液中與五硫化二
27、磷在118℃反應(yīng)4h制得巰嘌呤。,,(一)鑒別(1)本品加乙醇溶解后,與醋酸鉛乙醇溶液反應(yīng),生成巰嘌呤鉛黃色沉淀。,,(2)巰嘌呤分子上的巰基(—SH)與強氧化劑濃硝酸作用,被氧化成6-嘌呤亞磺酸,進一步氧化成黃色的6-嘌呤磺酸,再與氫氧化鈉試液反應(yīng),生成呈黃棕色的6-嘌呤磺酸鈉。,,(3)巰嘌呤分子上的巰基(—SH)與氨試液反應(yīng),生成銨鹽,溶解度增大,溶液變澄清,再與硝酸銀試液反應(yīng),生成溶解度較小的巰嘌呤銀白色絮狀沉淀,在
28、熱硝酸中不溶。(4)本品的紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜一致。,(二)檢查1. 6-羥基嘌呤 6-羥基嘌呤為巰嘌呤的合成中間體,其結(jié)構(gòu)與巰嘌呤僅差一個取代基:一個是羥基取代,一個是巰基取代。精制不完全會有殘留,對巰嘌呤的安全使用有影響。 《中國藥典》(2015年版) 利用兩者在紫外吸收圖譜上的差異,采用紫外-可見分光光度法對6-羥基嘌呤的量進行控制,巰嘌呤在325nm處具有強烈的紫
29、外吸收,而6-羥基嘌呤的最大吸收波長在255nm、325nm處基本無吸收,故通過規(guī)定255nm與325nm波長處的吸光度比值不得過0.06,即可對6-羥基嘌呤的量進行控制。,,2.硫酸鹽 本品在生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生硫酸鹽雜質(zhì), 《中國藥典》(2015年版) 采用在鹽酸溶液中,不得與氯化鋇反應(yīng)產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象來控制硫酸鹽雜質(zhì)。3.水分 對于含有結(jié)晶水的藥物需對其水分進行測定,巰嘌呤水分的含量約為10.6%
30、, 《中國藥典》(2015年版) 規(guī)定采用費休氏法測定水分,含量應(yīng)在10.0% ~12.0%。,,4.重金屬 巰嘌呤分子結(jié)構(gòu)中含有可與重金屬結(jié)合的巰基,采用第一法進行重金屬檢查會產(chǎn)生假陰性的結(jié)果,故《中國藥典》(2015年版)采用第二法(熾灼后的硫代乙酰胺法)對巰嘌呤中的重金屬進行檢查。該法需先將供試品高溫熾灼破壞成無機物后再進行重金屬檢查,熾灼溫度對檢查結(jié)果影響較大,溫度越高,重金屬損失越多,因此熾灼溫度應(yīng)控
31、制在500℃ ~600℃。,(三)含量測定,巰嘌呤具有很強的紫外吸收,在0.1mol/L鹽酸溶液中,其最大吸收波長325nm處的吸收系數(shù)可達1265?!吨袊幍洹罚ǎ玻埃保的臧妫?采用紫外分光光度法中的吸收系數(shù)法對其進行含量測定。具體方法:取本品,精密稱定,加0.1mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋至每1ml中約含5μg的溶液,照紫外可見分光光度法,在325nm的波長處測定吸光度,C5H4N4S的吸收系數(shù)(E1%1cm)為1
32、265,計算即得。,二、三磷酸腺苷二鈉 三磷酸腺苷二鈉為核苷酸衍生物,直接參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖、核酸以及核苷酸的代謝,與組織生長、修補及再生均有密切關(guān)系,是體內(nèi)能量的主要來源,能擴張冠狀動脈及周圍血管,具有改善機體代謝的作用。 藥用三磷酸腺苷二鈉為二鈉鹽,含3個結(jié)晶水。臨床上主要用于心力衰竭、心肌炎、腦動脈硬化、腦出血后遺癥、急性脊髓灰質(zhì)炎、進行性肌肉萎縮等疾病
33、的治療。目前三磷酸腺苷二鈉生產(chǎn)方法主要為發(fā)酵法。以腺嘌呤核苷酸為原料,在啤酒酵母的發(fā)酵條件下生成三磷酸腺苷,然后進一步純化、結(jié)晶成三磷酸腺苷二鈉。,(一)鑒別(1)取本品約20mg,加稀硝酸2ml溶解后,加鉬酸銨試液1ml,水浴加熱,放冷,即析出黃色沉淀。此鑒別反應(yīng)可驗證其是否為磷酸鹽。(2)取本品水溶液(3→10000)3ml,加3,5-二 羥基甲苯乙醇溶液(1→10)0.2ml,加硫酸亞鐵銨鹽酸溶液(1→1000)3ml
34、,置水浴中加熱10min,即顯綠色。此鑒別反應(yīng)為核糖基的地衣酚反應(yīng)。(3)本品的紅外吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜(《藥品紅外光譜集》903圖)一致。主要比較下列幾個特征吸收譜帶的峰型、峰位及相對強度是否一致。(4)本品為鈉鹽,也需對其進行鑒別?!吨袊幍洹芬?guī)定采用焰色反應(yīng)進行鑒別。,(二)檢查 三磷酸腺苷二鈉主要采用發(fā)酵法進行制備,以腺嘌呤核苷酸為原料,在啤酒酵母的發(fā)酵條件下生成三磷酸腺苷,然后進一步純化、結(jié)晶成三
35、磷酸腺苷二鈉。 根據(jù)生產(chǎn)過程及貯藏過程中可能產(chǎn)生雜質(zhì)的情況,需要進行酸度、溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、水分、氯化物、重金屬、鐵鹽和細菌內(nèi)毒素等8項檢查。,1.酸度 三磷酸腺苷二鈉雖然為鈉鹽,但總體仍呈現(xiàn)為酸性,質(zhì)量標準要求本品用水制成50mg/ml的溶液,其pH值應(yīng)為2.5~3.5。2.有關(guān)物質(zhì) 本品對溫度較敏感,在常溫下易分解為二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉。發(fā)酵過程中產(chǎn)生
36、的二磷酸腺苷、一磷酸腺苷等副產(chǎn)物在純化、結(jié)晶過程中也會一起形成二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉,結(jié)構(gòu)與三磷酸腺苷二鈉類似,難以完全除去。 本品的有關(guān)物質(zhì)檢查主要控制的就是這兩個雜質(zhì)的含量,具體檢查內(nèi)容如下:照含量測定項下三磷酸腺苷二鈉的重量比的方法測定,按下式計算不得大于5.0%。,,3.水分 三磷酸腺苷二鈉含有3個結(jié)晶水,理論含水量為8.9%, 《中國藥典》(2015年版)采用卡氏水分測定法
37、測定其含水量應(yīng)在6.0% ~12.0%。 由于三磷酸腺苷二鈉幾乎不溶于乙醇、乙醚、三氯甲烷等有機溶劑,在甲醇中溶解度低,因此采用乙二醇-無水甲醇(60∶40)作為溶劑。檢測時攪拌速度、時間對測定結(jié)果影響較大,一般需攪拌10min左右,使樣品完全溶解后再滴定。,(三)含量測定 由于二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉等雜質(zhì)的干擾難以除去,故本品采用先測定總核苷酸含量和三磷酸腺苷二鈉的重量比,然后通
38、過計算獲得三磷酸腺苷二鈉的準確含量,具體方法如下。1.總核苷酸的含量測定 取本品適量,精密稱定,加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉35.8g,加水至1000ml作為A液,取無水磷酸二氫鉀13.6g,加水至1000ml作為B液,?。乱哼m量,加入A液中,調(diào)pH值至7.0,使溶解并定量稀釋制成每1ml中含20μg的溶液,照紫外可見分光光度法測定,在259nm的波長處測定吸光度,按C10H14N5Na2O13P3的吸收系
39、數(shù)(E1%1cm)為279計算。,2.三磷酸腺苷二鈉的重量比的測定 照高效液相色譜法測定(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用末端封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,以0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(取磷酸氫二鈉35.8g,磷酸氫二鉀13.6g,加水900ml溶解,用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.0, 加入四丁基溴化銨1.61g,加水至1000ml, 搖勻) -甲醇(95∶5)為流動相,柱溫為35℃,檢測波長
40、為259nm,理論板數(shù)按三磷酸腺苷二鈉峰計算不低于1500,出峰次序依次為一磷酸腺苷鈉、二磷酸腺苷二鈉與三磷酸腺苷二鈉,各色譜峰的分離度應(yīng)符合要求(圖8-1),(2)測定法 取本品適量,精密稱定,加流動相溶解并定量稀釋制成每1ml含0.4mg的溶液,精密量?。保唉蹋熳⑷胍合嗌V儀,記錄色譜圖,計算三磷酸腺苷二鈉在總核苷酸中的重量比。,,3.三磷酸腺苷二鈉含量的計算 三磷酸
41、腺苷二鈉含量% = (總核苷酸×三磷酸腺苷二鈉的重量比) ×100%式中各符號的含義同有關(guān)物質(zhì)檢查的計算公式。,一、鑒別,(一)化學鑒別 1戊糖的鑒別 (1)地衣酚反應(yīng) (2)二苯胺反應(yīng) 2磷酸鹽的鑒別 3嘌呤堿的鑒別(二)光譜鑒別 1. 紫外吸收光譜
42、法 2. 紅外吸收光譜法,二、檢查,核糖核酸、脫氧核苷酸鈉多采用提取法制備,核酸堿基、核苷、核苷酸類藥物大多采用酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備。(一)多核苷酸類藥物的檢查 1吸光度 2核糖核酸中脫氧核糖核酸的檢查 3增色效應(yīng)(二)核苷酸、核苷、核酸堿基類藥物的檢查 1有關(guān)物質(zhì)
43、 結(jié)構(gòu)相似的其他非目標化合物,即有關(guān)物質(zhì)。 2 含氯量 3含氟量,三、含量測定,1、核酸類藥物結(jié)構(gòu)中的嘧啶堿和嘌呤堿,具有一定的弱堿性,可采用非水堿量法進行含量測定;2、其共軛結(jié)構(gòu)具有一定的紫外吸收,可通過測定最大吸收波長的吸光度來測定含量3、紫外檢測器的HPLC法定量。 大多數(shù)核酸類藥物可用常規(guī)的反相高效液相色譜法進行分離測
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