富勒烯(C60)對核酸分子的損傷效應研究.pdf

1、碳納米材料的毒性效應日益受到廣泛關注。在本研究中，利用不同實驗方法和設計多種反應條件(溫度，時間和離子強度等)，來檢測富勒烯(C60)以及C60Cu2+在避光條件下對質粒DNA構象的影響；并且以mRNA的reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)為體外實驗模型，研究C60對RT反應的影響，借以評估碳納米材料的生物毒性，并闡明C60與生物大分子相互作用關系及其毒性作用的分

2、子機制。
　　 C60對DNA構象影響的實驗結果顯示在非光催化條件下，C60可顯著誘導DNA構象從超螺旋DNA轉變成開環(huán)DNA或線性DNA，并且這種效應隨C60濃度的增加，反應溫度的升高以及時間的延長而增強；為了研究C60剪切DNA的作用機制，我們通過檢測活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)捕獲劑對C60剪切DNA作用的影響，來探討這種剪切效應是否與ROS相關，實驗結果顯示單線態(tài)氧(1O2)的捕獲

3、劑均能有效消除C60對DNA的剪切作用，同時我們利用商品化試劑盒檢測反應體系中1O2的生成情況，實驗結果顯示二甲基-4-亞硝基苯胺(N，N-Dimethyl-p-nitrosoaniline，RNO)吸光值隨C60濃度的升高，溫度的升高以及時間的延長顯著下降；為了研究C60剪切DNA的作用是否具有位點特異性，我們利用不同限制性內(nèi)切酶酶切C60處理后的線性DNA，實驗結果顯示線性DNA不能被多種限制性內(nèi)切酶酶切成兩個不同長度的DNA片段，

4、另外，為了深入探討C60剪切DNA的作用機制是否與水解相關，我們利用T4 DNA連接酶連接C60處理后的斷裂DNA，發(fā)現(xiàn)斷裂DNA不能被T4 DNA連接酶連接成超螺旋DNA，但是我們發(fā)現(xiàn)有部分線性DNA被連接成開環(huán)DNA；最后，為了研究C60與DNA之間的相互作用關系，我們利用熒光定量PCR熔解曲線分析C60對PCR產(chǎn)物Tm值的影響，以及利用UV-Vis分光光度計檢測C60對DNA UV-Vis吸收譜的影響，實驗結果顯示C60可顯著降低

5、DNA的Tm值，并且可促使DNA UV-Vis吸收譜發(fā)生紅移現(xiàn)象。上述研究結果表明在非光催化條件下，C60可誘導DNA構象的改變，并且這種效應與C60濃度，反應溫度和時間密切相關；并且C60可與DNA相互作用，改變DNA構象穩(wěn)定性；溶液中1O2的生成是C60誘導DNA斷裂的主要原因，并且這種剪切作用沒有位點特異性。
　　 為了探討金屬離子與C60復合效應對生物大分子的毒性效應，我們研究了多種金屬離子和C60復合效應對DNA構象的

6、影響，實驗結果顯示在非光催化條件下，C60/Mg2+，C60/Mn2+，C60/Ca2+和C60/Zn2+對質粒DNA構象沒有明顯影響，C60/CU2+可顯著誘導DNA構象從超螺旋DNA轉變成開環(huán)DNA，并且C60/Fe3+可誘導DNA完全降解。通過檢測不同濃度Cu2+和C60復合效應對DNA構象的影響，我們發(fā)現(xiàn)在非光催化條件下，C60/Cu2+對DNA的剪切效應隨C60和Cu2+的濃度升高而增強。為了進一步研究C60/Cu2+誘導DN

7、A斷裂的作用機制，我們利用T4 DNA連接酶連接C60/Cu2+反應后的斷裂DNA，同時檢測不同ROS捕獲劑對C60/Cu2+剪切DNA作用的影響，實驗結果顯示斷裂DNA被T4 DNA連接酶連接成沒有缺口的開環(huán)DNA，并且不同的ROS捕獲劑均不能有效消除C60對DNA的剪切作用。上述研究結果表明在非光催化條件下，C60/Cu2+的復合效應可有效誘導DNA斷裂，并且這種效應與C60和Cu2+的濃度密切相關。
　　 C60對RT反應