鐵螯合劑對微生物的抑制作用【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　鐵螯合劑對微生物的抑制作用</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品質(zhì)量與安全

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</b></p&

3、gt;<p><b>　　0引言1</b></p><p><b>　　1材料與方法2</b></p><p><b>　　1.1 材料2</b></p><p>　　1.1.1 菌種2</p><p>　　1.1.2 試劑2</p>&l

4、t;p>　　1.1.3 培養(yǎng)基2</p><p>　　1.1.4 主要儀器設(shè)備2</p><p><b>　　1.2 方法3</b></p><p>　　1.2.1 斜面保種3</p><p>　　1.2.2 試劑配制3</p><p>　　1.2.3 培養(yǎng)基配制3</p&

5、gt;<p>　　1.2.4 菌懸液的制備3</p><p>　　1.2.5 鐵螯合劑對微生物的最低抑制濃度（MIC）測定3</p><p><b>　　2結(jié)果與討論4</b></p><p>　　2.1 鐵螯合劑對革蘭氏陰性菌的抗菌效果4</p><p>　　2.2 鐵螯合劑對革蘭氏陽性菌的抗菌效

6、果5</p><p>　　2.3 鐵螯合劑對霉菌的抗菌效果6</p><p><b>　　2.4 討論6</b></p><p><b>　　3結(jié)論7</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)8</b

7、></p><p>　　摘 要：為了了解新型鐵螯合劑CP262、CP263、 LMS 0514a、LMS 0521a、LMS 0608a、LMS 0609a、LMS 0610c、LMS 0611、LMS 0612的體外抗菌活性，為人們在抗菌方面提供多一些選擇。通過液體試管法測定9種新型鐵螯合劑對微生物的最低抑制濃度(MIC)，并與DTPA作對比研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，新型鐵螯合劑CP262、CP263、 LM

8、S 0514a、LMS 0521a、LMS 0608a、LMS 0609a、LMS 0610c、LMS 0611、LMS 0612對細(xì)菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用。其中，對革蘭氏陰性菌抑制效果最好的是LMS 0610c(MIC值為16µg/mL)，抗菌效果好于DTPA(MIC值為40µg/mL)；對革蘭氏陽性菌抑制效果較好的是DTPA、LMS 0514a、

9、LMS 0521a、LMS 0609a和LMS 0611 (MIC值均為40µg/mL)。 </p><p>　　關(guān)鍵詞：微生物；鐵螯合劑；最低抑制濃度；抑制作用</p><p>　　Abstract: In order to study the antibacterial activity of new iron chelating agent of CP262, CP263,

10、 LMS 0514a, LMS 0521a, LMS 0608a, LMS 0609a, LMS 0610c, LMS 0611, LMS 0612 against microbes, so that people have more choices in inhibiting microbial growth. MIC values of nine kinds of new iron chelating agent against m

11、icrobes were determined with liquid tube method and compared with those of DTPA. The tested results showed that the iron chelating agent of CP262, CP263, LMS 0514a, LMS 0521a, LMS 0</p><p>　　Keywords: Microb

12、e; Iron chelating agent; The minimum inhibition concentrations; Inhibition</p><p><b>　　0引言</b></p><p>　　自然界有害細(xì)菌分布非常廣泛，而且數(shù)量龐大，種類繁多，它們不僅會引起各種材料的分解、變質(zhì)和腐敗，同時還嚴(yán)重威脅著人們的健康。每年因食物被微生物污染而導(dǎo)致的食物

13、中毒事件，以及曾在世界范圍內(nèi)因細(xì)菌傳染而引起的霍亂、瘧疾、結(jié)核病導(dǎo)致人類的死亡頻頻見報等使得人類不斷采取各種方法來抗菌。尤其是現(xiàn)在，隨著生活水平的提高和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對生活環(huán)境的認(rèn)識和要求也在不斷的提高，特別是對健康的意識也在不斷增強(qiáng)，使得人們對抗菌課題的關(guān)注也不斷提高，尤其是在一些致病菌對一些藥物等產(chǎn)生了耐藥性，傳統(tǒng)的一些抗菌劑失去效用后，開發(fā)、研究更多的新型抗菌劑就成為迫切的需要。因而抗菌劑的研究和發(fā)展成為人類一直關(guān)注的課

14、題。</p><p>　　抗菌劑的研究、開發(fā)始于20世紀(jì)80年代初[1]。目前，已經(jīng)研制出來并在各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的抗菌劑主要有：有機(jī)抗菌劑、無機(jī)抗菌劑和復(fù)合抗菌劑3 類。</p><p>　　有機(jī)抗菌劑包括從一些動物體內(nèi)提取出的具有抗菌活性的高分子有機(jī)物的天然抗菌劑和研究學(xué)者合成的合成型有機(jī)抗菌劑。目前普遍認(rèn)為有機(jī)抗菌劑的殺菌作用機(jī)理是[1]：帶有正電荷的有機(jī)分子鏈與細(xì)菌和霉菌的細(xì)胞膜

15、表面陰離子結(jié)合或與巰基反應(yīng)，從而破壞有害微生物細(xì)胞膜的組成，使其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)如: K+、DNA、RNA 等泄漏，最終導(dǎo)致菌體死亡，從而起到抑菌、殺菌的目的。最常見的天然有機(jī)抗菌劑是殼聚糖及其衍生物。于1979年，Allan指出，殼聚糖具有安全廣譜的抗菌性能[2]，對自然界的細(xì)菌、酵母菌、真菌等微生物均有不同程度的抑制作用[3]。但殼聚糖只能在酸性領(lǐng)域內(nèi)顯示出抗菌活性[4]，為了發(fā)揮殼聚糖的抗菌活性及擴(kuò)大其應(yīng)用范疇，研究人員紛紛對其進(jìn)行改性

16、，研究出同樣具備很好的抗菌活性的殼聚糖衍生物。朱一凡[5]等人將殼聚糖季銨化，用含季銨化的殼聚糖200 mg/L的抗菌劑溶液對大腸桿菌作用5 min，殺滅菌的對數(shù)值>5.00；對金黃色葡萄球菌作用2.5 min，殺滅菌的對數(shù)值>5.00。而以含季銨化殼聚糖1000 mg/L的該抗菌劑溶液白色念珠菌作用5 min，殺滅菌的對數(shù)值>5.00。季銨化殼聚糖均顯示出了良</p><p>　　無機(jī)抗菌劑主

17、要是利用一些具有抗菌能力的無機(jī)成分通過各種方法與載體結(jié)合而制得的。根據(jù)殺菌機(jī)理的不同可分為金屬離子型和光催化型兩種無機(jī)抗菌劑。金屬離子型無機(jī)抗菌劑的主要品種包括以沸石、硅膠、磷鹽等多孔材料或?qū)訝罹w材料為載體的銀、銅、鋅等金屬離子無機(jī)抗菌劑。徐光亮等人[8]，利用干濕循環(huán)法以天然礦物斜發(fā)沸石為載體，制備出一種含鋅量很高的無機(jī)抗菌劑；當(dāng)鋅含量為 10.32 %時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有很大的抗菌活性，殺菌率均大于99.9 %。而光

18、催化型無機(jī)抗菌劑的品種主要包括銳鈦型TiO2、ZnO、SiO2等。其中，納米TiO2具有活性高、耐熱性好及熱穩(wěn)定性、持續(xù)性長、安全性高、即效性好等優(yōu)點(diǎn)，因而是最受關(guān)注的無機(jī)抗菌劑之一。徐瑞芬等[9]將納米TiO2添加到苯丙乳液中，由此制得的抗菌涂料對大腸桿菌、枯草芽孢和金黃色葡萄球菌的殺菌率均達(dá)到了99%以上，且殺菌徹底、抗菌長效。許秋穎等人[10]制備出納米TiO2苯丙聚合物乳液，該納米TiO2復(fù)合抗菌涂膜經(jīng)自然光照射24h后，對大腸

19、桿菌的抗菌活性也不錯，殺菌率達(dá)84%。</p><p>　　復(fù)合抗菌劑是通過不同的方式將不同類型的抗菌劑化合，以合理利用這些抗菌劑的優(yōu)點(diǎn)，使這些參與化合的抗菌劑相互作用，取長補(bǔ)短，達(dá)到提高抗菌性能和擴(kuò)大使用范圍的效果。張欣等人[11]研究合成了?；吝蜻cCu2+、Co2+、Zn2+、Ni+的配合物，實(shí)驗(yàn)表明配體和配合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有一定的抑制作用，但配合物的抑菌活性比配體的高，說明配合物形成后

20、,過渡金屬離子對配體的抑菌活性起到了增強(qiáng)的效應(yīng)。</p><p>　　最近，一些學(xué)者通過有機(jī)合成技術(shù)，研究合成了幾種新型抗菌劑，并提出了一個新的抗菌理念——通過螯合作用，螯合培養(yǎng)基中微生物生長所必需的鐵離子來達(dá)到抗菌的目的。</p><p>　　鐵元素是地殼中含量最豐富的元素之一。鐵幾乎是所有生物體進(jìn)行生命活動所必需的元素，對于微生物也不例外，是微生物生長所必需的營養(yǎng)之一。鐵在微生物生長過

21、程中的作用主要有：①構(gòu)成有機(jī)化合物，合成菌體組分；②調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓；③作為酶的組成成分，維持酶的活性；④參與能量的儲存和轉(zhuǎn)運(yùn)；⑤與微生物生長繁殖和致病作用密切相關(guān)[12]。在微生物的生長過程中，鐵的最低濃度約為10-7~10-5M[13]。因此，通過螯合作用螯合微生物生長環(huán)境中的鐵離子，使鐵離子的濃度低于其生長所必需的濃度，從而抑制微生物的生長，即可達(dá)到抗菌的效果。鐵離子螯合劑就是根據(jù)這一原理被開發(fā)研究出來的，是一種新型的抗菌劑，并在

22、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。Adriaan[14]等人于93年合成具有螯合三價鐵功能的HMP，實(shí)驗(yàn)證明，該鐵螯合劑能有效抑制供試菌株大腸桿菌和李斯特氏菌的生長。鐵離子螯合劑二乙烯三胺五乙酸（Dietlylene triamine-penta acetic acid, DTPA）已在醫(yī)療領(lǐng)域上得應(yīng)用 [15]。M. A., M. D., D. C. H. Robert McDonald[16]用去鐵胺與DT</p>&

23、lt;p>　　由于鐵螯合劑的有效抑菌作用，最近，人們開發(fā)了幾種新型的鐵螯合劑，基于螯合劑螯合培養(yǎng)基中微生物生長所需的鐵離子來達(dá)到抗菌的目的的這樣一個理念，我們將對它們進(jìn)行抗菌效果的檢驗(yàn)。并且將它們的抗菌性能與DTPA的抗菌性能進(jìn)行比較，為人們在抗菌方面有更多的選擇。</p><p><b>　　1材料與方法</b></p><p><b>　　1.1

24、材料</b></p><p><b>　　1.1.1 菌種</b></p><p>　　革蘭氏陰性細(xì)菌（G-菌）：大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)</p><p>　　革蘭氏陽性細(xì)菌（G+菌）：金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、蠟樣

25、芽胞桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)</p><p>　　真菌：指狀青霉(Penicillium digitatum)</p><p>　　上述菌株均由實(shí)驗(yàn)室分離得到。</p><p><b>　　1.1.2 試劑</b></p><p>　　鐵螯合劑：CP262

26、、CP263和LMS系列的0514a、0521a、0608a、0609a、0610c、0611、0612以及DTPA。</p><p><b>　　1.1.3 培養(yǎng)基</b></p><p>　　?腦心浸液瓊脂 (Brain Heart Infusion Agar, 蘇州興化市聯(lián)發(fā)化工試劑有限公司)</p><p>　　?腦心浸液培養(yǎng)基(Bra

27、in Heart Infusion Medium, 蘇州興化市聯(lián)發(fā)化工試劑有限公司)</p><p>　　?孟加拉紅培養(yǎng)基（Rose Bengal Medium, 杭州微生物試劑有限公司）</p><p>　　?馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）</p><p>　　1.1.4 主要儀器設(shè)備</p><p>　　培養(yǎng)皿、15×7

28、5mm玻璃試管、移液槍（50µL、1000µL、5000µL）、槍頭、移液管、吸耳球、酒精燈、試劑瓶、錐形瓶、量筒、燒杯、玻璃棒、鑷子、牛津杯、記號筆、廢物缸等。</p><p>　　快速蒸汽滅菌鍋（天津超拓制造）；生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；無菌操作臺（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（寧波江南儀器廠）；密封式恒溫可調(diào)電爐（嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司）

29、；電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 斜面保種</p><p>　　細(xì)菌短期保藏：普通營養(yǎng)瓊脂斜面劃線，37℃下培養(yǎng)24小時后，用報紙包扎置于冰箱中冷藏保藏。一般15~30天轉(zhuǎn)管一次。</p><p>　　細(xì)菌長期保藏：普通營養(yǎng)瓊脂斜

30、面劃線，37℃下培養(yǎng)24小時后，往長好的斜面菌試管中加入已滅菌的石蠟油至高出斜面頂部約1cm（故斜面不宜過長），用報紙包扎置于冰箱中冷藏保存。</p><p>　　霉菌：PDA培養(yǎng)基斜面劃線，28℃下培養(yǎng)48小時后，用報紙和塑料袋包扎置于冰箱中冷藏保藏。</p><p>　　1.2.2 試劑配制</p><p>　　鐵螯合劑：分別稱取30mg抗菌劑（CP262、CP

31、263和LMS系列的0514a、0521a、0608a、0609a、0610c、0611、0612以及DTPA）粉末，溶于5mL的雙蒸水中，待全部溶解后，轉(zhuǎn)移到10mL的容量瓶中，定容到10mL，作為這些抗菌劑的母液（3000ppm）。水溶性不是很好的抗菌劑，配制時可適當(dāng)加熱和超聲。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，適當(dāng)稀釋抗菌劑母液，配制成實(shí)驗(yàn)所需的一系列不同濃度（200、300、500、1000、1500、2000、2500ppm等）的抗菌劑試劑。

32、</p><p>　　1.2.3 培養(yǎng)基配制</p><p>　　?腦心浸液瓊脂：在洗凈晾干的300mL錐形瓶中稱取10g腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHI)，然后加入200mL蒸餾水混合，在電爐上加熱攪拌至完全混合、溶解。在溫度121℃下高壓滅菌20分鐘。允許瓊脂在室溫下凝固，但如果培養(yǎng)基想儲存一段時間，必須在24小時內(nèi)包裝在無菌裝置中。它們可以保存在冷藏中直到使用。</p>&l

33、t;p>　　?腦心浸液培養(yǎng)基：稱取3.7g腦心浸液培養(yǎng)基和100mL蒸餾水加入250mL的錐形瓶中，加熱并攪拌至完全溶解，然后在溫度121℃下高壓滅菌20分鐘。</p><p>　　?孟加拉紅培養(yǎng)基：稱取7.2g孟加拉紅培養(yǎng)基（虎紅瓊脂）溶于200mL蒸餾水中，加熱并攪拌至完全溶解，然后在溫度121℃下高壓滅菌20分鐘。</p><p>　　?馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：

34、稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮爛（煮沸20~30分鐘，能被玻璃棒戳破即可），用四層紗布過濾，再據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要加葡萄糖和瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000毫升，分裝試管，加塞、包扎，（121℃）滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　1.2.4 菌懸液的制備</p><p>　　細(xì)菌：分別從斜面菌種上通過無菌操作的方法挑取一環(huán)接

35、種到已編號的腦心浸液瓊脂斜面上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，活化菌株。然后再從已活化的菌種中分別挑取一環(huán)接種到5mL的腦心浸液培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24小時。接著，用移液器吸取50μL轉(zhuǎn)移一支新的的腦心浸液培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到其終濃度達(dá)到107 cfu/mL，大約需要18~ 20小時。</p><p>　　霉菌：通過無菌操作的方法用接種環(huán)挑取少許菌體于裝無菌水的試管中

36、，震蕩混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌懸液的濃度，使其含孢子量約為107個/mL。</p><p>　　1.2.5 鐵螯合劑對微生物的最低抑制濃度（MIC）測定</p><p>　　最低抑制濃度（MIC）測定是指測定抗菌劑抑制微生物生長的最低濃度[17]。</p><p>　　對于細(xì)菌，在試管中加入一定量的菌液和一系列不同濃度的抗菌劑，待螯合作用結(jié)束后，在溫度37℃下

37、培養(yǎng)24小時，用肉眼觀察試管菌液的渾濁度。具體方法如下：</p><p>　　所有的試樣將在15×75mm的試管中進(jìn)行，培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基，無菌操作。取無菌試管排成排，用移液槍往試管里加入抗菌劑和菌懸液。所有的試管中包含80µL抗菌劑和20µL菌懸液。對照管中只包含80μL無菌水和20μL菌懸液?？咕鷦┖途鷳乙杭尤虢Y(jié)束后，用已滅菌烘干的試管塞將試管塞好，拿到37℃恒溫培養(yǎng)箱箱中，

38、靜置2小時，進(jìn)行螯合作用。接著用培養(yǎng)基將所有試管總體積補(bǔ)足1000μL，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。每一種抗菌劑的各個濃度對供試菌株的螯合作用實(shí)驗(yàn)設(shè)3個試管平行。用肉眼觀察試管菌液的渾濁度，以肉眼可見渾濁度最小的最低抗菌劑濃度為測定抗菌劑對檢測菌的最低抑菌濃度(MIC)。</p><p>　　對于霉菌，在牛津杯測試培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上[16]進(jìn)行改良。具體方法如下：</p><p>　　

39、取200µL抗菌劑和5mL滅菌孟加拉紅培養(yǎng)基混合均勻后加入平板培養(yǎng)皿中，同時200µL無菌水+5mL滅菌孟加拉紅培養(yǎng)基做空白對照，待培養(yǎng)基凝固后，在平皿中央放入滅菌牛津杯，并注入10µL的霉菌孢子懸液。靜置待懸液緩慢擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂中，在28℃，相對濕度75%條件下培養(yǎng)，待空白樣霉菌長滿整個平板時，以長霉菌數(shù)最小的最低抗菌劑濃度為最低抑制濃度，每個濃度2平行。</p><p><b

40、>　　2結(jié)果與討論</b></p><p>　　2.1 鐵螯合劑對革蘭氏陰性菌的抗菌效果</p><p>　　鐵螯合劑對革蘭氏陰性菌的最低抑制濃度(MIC)見表1。</p><p>　　表1 鐵螯合劑對革蘭氏陰性菌的最低抑制濃度(MIC)測定結(jié)果</p><p>　　Tab.1 The MIC results of iron

41、 chelating agents against Gram-negative bacterium</p><p>　　由上表可知，鐵螯合劑CP262、CP263和LMS系列的0514a、0521a、0608a、0609a、0610c、0611、0612以及DTPA對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、銅綠假單胞菌均有抑制作用，對大腸桿菌的最低抑制濃度分別為：40µg/mL、40µg/mL、24µ

42、g/mL、24µg/mL、120µg/mL、240µg/mL、16µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、40µg/mL；對銅綠假單胞菌的最低抑制濃度分別為：40µg/mL、40µg/mL、16µg/mL、24µg/mL、240µg/mL、240µg/mL、16µg/mL、40µg/m

43、L、40µg/mL、40µg/mL。其中，LMS 0610c（MIC值為16µg/mL）有著最好的抑制效果。其余幾個新型抗菌劑的抑制效果大小順序?yàn)椋?LMS 0514a＞LMS 0521a＞LMS 0611、CP262、CP263、LMS 0612＞LMS 0608a＞LMS 0609a。</p><p>　　2.2 鐵螯合劑對革蘭氏陽性菌的抗菌效果</p><p

44、>　　鐵螯合劑對革蘭氏陽性菌的最低抑制濃度(MIC)見表2。</p><p>　　表2 鐵螯合劑對革蘭氏陽性菌的最低抑制濃度(MIC)測定結(jié)果</p><p>　　Tab.2 The MIC results of iron chelating agents against Gram-positive bacterium</p><p>　　由上表可看出，鐵螯合

45、劑CP262、CP263和LMS系列的0514a、0521a、0608a、0609a、0610c、0611、0612以及DTPA對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌也有抑制作用，對金黃色葡萄球菌的MIC分別為：80µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、8

46、0µg/mL、40µg/mL；對蠟樣芽胞桿菌的MIC分別為：40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL；對枯草芽孢桿菌的MIC分別為：40µg/mL、240µg/mL、40µ

47、g/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、40µg/mL。其中，抑制效果較好的鐵螯合是DTPA、LMS 0514a、LMS0521a、LMS0609a和LMS0611，但抗菌效果不如革蘭氏陰性菌（MIC值≥40µg/mL）。</p><p>　　根據(jù)表1和表2，鐵螯合劑螯

48、合了細(xì)菌生長環(huán)境中的鐵離子，細(xì)菌的生長受到了抑制，說明鐵是微生物生長所必需的重要元素之一。雖然自然界中鐵元素是最豐富的元素之一，但在生理?xiàng)l件下其溶解性差，鐵離子的濃度不超過10-18M，而在微生物的生長過程中，其最低濃度約為10-7~10-5M。因此，微生物需要形成一套高效的鐵運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制獲得鐵離子，達(dá)到它們生存所需的濃度。這些機(jī)制包括：一.合成嗜鐵素。嗜鐵素是一類低分子量鐵螯合物，對鐵具有較高的親和力，故可介導(dǎo)微生物細(xì)胞的鐵攝取。二.合成

49、蛋白水解酶。微生物可合成蛋白水解酶并釋放到周圍環(huán)境中，以降解宿主鐵結(jié)合蛋白，從中獲得所需的鐵[19]。三.利用乳鐵蛋白受體獲取鐵。有些細(xì)菌如鏈球菌，其菌體膜上表達(dá)乳鐵蛋白受體，可直接與宿主乳鐵蛋白結(jié)合，由此可從宿主含鐵蛋白上獲取鐵[20]。這些鐵轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中最重的一種是利用嗜鐵素來螯合環(huán)境中的鐵，進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)鐵。</p><p>　　以銅綠假單胞菌為例，它能分泌合成兩種嗜鐵素，分別是熒光鐵載體和非熒光鐵載體。熒光鐵載體

50、對多種金屬離子有相對低的親和力，能親和多種金屬離子，如Mo6+，Co2+，F(xiàn)e3+等；非熒光鐵載體則特異性負(fù)責(zé)對鐵離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。在培養(yǎng)基中加入抗菌劑后，抗菌劑就開始螯合培養(yǎng)基中的鐵離子。當(dāng)培養(yǎng)基中的鐵離子越來越少時，銅綠假單胞菌則會分泌出上述兩種嗜鐵素，以完成鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)該菌對鐵離子的吸收利用。但在試驗(yàn)中，加入鐵螯合劑后，其生長仍受到很大程度的抑制，可能原因是其分泌的嗜鐵素對鐵離子的螯合能力不如這些抗菌劑螯合金屬的能力，所

51、以生長受到了抑制。</p><p>　　2.3 鐵螯合劑對霉菌的抗菌效果</p><p>　　霉菌的抗菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一次，初步結(jié)果顯示對霉菌的抑菌效果不是很好，鐵螯合劑對霉菌的抑制作用還需要在以后繼續(xù)探討研究。</p><p><b>　　2.4 討論</b></p><p>　　CP262、CP263和LMS系列的051

52、4a、0521a、0608a、0609a、0610c、0611、0612鐵螯合劑以及DTPA這10個抗菌劑均對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌有不同程度的抑制作用。由表1可知，這些新型抗菌劑對革蘭氏陰性菌的抑制作用中，LMS 0610c有著最好的抑制效果。由表2可知，這些螯合劑對于革蘭氏陽性菌的抑制效果較好的是DTPA、LMS 0514a、LMS0521a、LMS0609a和LMS0611。在本試驗(yàn)中，

53、鐵螯合劑對革蘭氏陰性菌的抑制效果好于革蘭氏陽性菌。究其原因，可能跟細(xì)菌的結(jié)構(gòu)有關(guān)。</p><p>　　通常，營養(yǎng)物要通過細(xì)胞外膜可由孔蛋白來完成，但對于鐵—嗜鐵素復(fù)合物，由于分子量較大，不能通過被動擴(kuò)散方式進(jìn)入，它的轉(zhuǎn)運(yùn)需要受體和能量的參與。對于革蘭氏陽性菌，其受體蛋白在質(zhì)膜上，能傳遞鐵—嗜鐵素復(fù)合物到以ATP為能量來源的ABC結(jié)合盒型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding-cassette, ABC），然后ABC系

54、統(tǒng)會幫助、促進(jìn)嗜鐵素復(fù)合物通過膜 [22]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)又叫ATP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，包括壁膜間隙蛋白、膜的通透酶和與ATP結(jié)合的脂蛋白，這三者用于結(jié)合不同的配體[23]。我們都知道革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌最大的差異在于它們的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁主要是由一層厚厚而緊密的肽聚糖和磷壁酸構(gòu)成，雖然結(jié)構(gòu)堅(jiān)固，但是細(xì)胞壁的選擇透過性還是比較差的，所以當(dāng)嗜鐵素和螯合劑跟三價鐵離子結(jié)合時，此種復(fù)合物還是能通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入到膜內(nèi)，

55、促進(jìn)革蘭氏陽性菌對培養(yǎng)基中鐵離子的利用。</p><p>　　但對于革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁比革蘭氏陽性菌薄而結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分外膜和肽聚糖層。外膜的基本成分是脂多糖，它同細(xì)胞質(zhì)膜一樣是雙層類脂。因此，鐵—嗜鐵素復(fù)合物必須都通過外膜和內(nèi)膜這脂雙層結(jié)構(gòu)才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而使得轉(zhuǎn)運(yùn)過程較為復(fù)雜。革蘭氏陰性菌會自己合成一系列特異性的高親和性的受體蛋白，使得它們能夠在細(xì)胞表面有效地結(jié)合鐵—嗜鐵素復(fù)合物。隨后，鐵—嗜鐵素結(jié)合物通過

56、主動運(yùn)輸方式進(jìn)入壁膜間隙，主動運(yùn)輸需要能量，此時則靠以質(zhì)子動勢作動力（proton motive force, PMF）的Ton系統(tǒng)。Ton系統(tǒng)包含TonB，ExbB和ExbD三個蛋白。其中，TonB被認(rèn)為是一種能量轉(zhuǎn)導(dǎo)物，可以把內(nèi)膜上產(chǎn)生的PMF偶聯(lián)到外膜受體上，為鐵—嗜鐵素復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)提供動力、能量使它們進(jìn)入壁膜間隙[24]。通過外膜進(jìn)入壁膜間隙后，接著要通過內(nèi)膜，這與革蘭氏陽性菌通過內(nèi)膜一樣，需要ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的參與，并借助細(xì)胞內(nèi)

57、ATP的水解產(chǎn)生的能量。由于革蘭氏陰性菌合成的外膜受體蛋白的特異性，使得外膜除了具有保障運(yùn)輸功能外，還有保護(hù)屏障作用，能阻止多種物質(zhì)通過，起到對多種抗生素有很強(qiáng)抵抗力的作用[25]。所以鐵—嗜鐵素—抗菌劑的</p><p>　　一般認(rèn)為芽孢菌的抗性較強(qiáng)。但是，我們發(fā)現(xiàn)在鐵螯合劑對革蘭氏陽性菌抑制作用實(shí)驗(yàn)中，芽孢菌的抗菌性與非芽孢菌相差無幾。 可能在芽孢菌產(chǎn)芽孢前，鐵螯合劑對其作用已完成。</p>&

58、lt;p><b>　　3結(jié)論</b></p><p>　　通過本次新型鐵螯合劑CP262、CP263、 LMS 0514a、LMS 0521a、LMS 0608a、LMS 0609a、LMS 0610c、LMS 0611、LMS 0612的體外抗菌活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：</p><p>　　1）鐵螯合劑CP262、CP263、 LMS 0514a、LMS 0521a、L

59、MS 0608a、LMS 0609a、LMS 0610c、LMS 0611、LMS 0612以及DTPA對細(xì)菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用，對大腸桿菌的最低抑制濃度分別為：40µg/mL、40µg/mL、24µg/mL、24µg/mL、120µg/mL、240µg/mL、16µg/mL、40µg/

60、mL、40µg/mL、40µg/mL；對銅綠假單胞菌的最低抑制濃度分別為：40µg/mL、40µg/mL、16µg/mL、24µg/mL、240µg/mL、240µg/mL、16µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、40µg/mL；對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度分別為：80µg/mL、80µg

61、/mL、40µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL；對蠟樣芽胞桿菌的最低抑制濃度分別為：40µg/mL、80µg/mL、40µg/mL、40µg/mL、80µg/mL、40µg</p><p>

62、;　　2）鐵螯合劑對革蘭氏陰性菌的抑制效果要好于革蘭氏陽性菌。</p><p>　　3）從鐵螯合劑對霉菌的抗菌效果試驗(yàn)可初步判定鐵螯合劑對霉菌的生長沒有多大的影響。</p><p>　　抗菌一直是人們所關(guān)注的話題，隨著人們的健康意識的不斷增加，越來越多的高效、安全、新型抗菌劑會不斷地被研制和開發(fā)，并在各領(lǐng)域的應(yīng)用也將會越來越廣泛。</p><p><b>

63、　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 孫洪, 夏英, 陳莉, 等. 國內(nèi)外抗菌劑的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J ] . 塑料工業(yè), 2006, 34(9) : 1－4.</p><p>　　[2] 季君暉, 史維明編. 抗菌材料[M ]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2003, 68.</p><p>　　[3] 李和平, 王月影, 高峰霞. 綠色抗

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