酶法提取烏賊眼中透明質(zhì)酸的研究【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　酶法提取烏賊眼中透明質(zhì)酸的研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 食品質(zhì)量與安

2、全 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></

3、p><p><b>　　0 前言1</b></p><p><b>　　1 材料與方法2</b></p><p>　　1.1實驗材料與儀器2</p><p><b>　　1.1.1原料2</b></p><p>　　1.1.2實驗試劑2</p

4、><p>　　1.1.3儀器與設(shè)備2</p><p>　　1.2 實驗方法2</p><p>　　1.2.1 烏賊眼玻璃體基本成分測定2</p><p>　　1.2.2 酶活力的測定—福林（Folin）法3</p><p>　　1.2.3 透明質(zhì)酸含量測定4</p><p>　　1.2.4

5、 工藝流程4</p><p>　　1.2.5 操作要點(diǎn)5</p><p>　　1.2.6酶解工藝單因素實驗5</p><p>　　1.2.7 酶解相應(yīng)面試驗分析6</p><p><b>　　2 結(jié)果與分析6</b></p><p>　　2.1烏賊眼液中基本成分測定6</p>

6、;<p>　　2.2 酶種類的選擇6</p><p>　　2.2.1酶活力測定6</p><p>　　2.2.2酶種類的確定7</p><p>　　2.3 加酶量對透明質(zhì)酸提取率的影響7</p><p>　　2.4酶解時間對透明質(zhì)酸提取率的影響8</p><p>　　2.5 酶解溫度對透明質(zhì)酸提

7、取率的影響8</p><p>　　2.6 pH對透明質(zhì)酸提取率的影響9</p><p>　　2.7 酶解條件的優(yōu)化10</p><p>　　2.7.1優(yōu)化試驗結(jié)果方差分析10</p><p>　　2.7.2響應(yīng)面直觀分析及酶解工藝的優(yōu)化11</p><p>　　2.8 驗證試驗13</p>&

8、lt;p><b>　　3 小結(jié)14</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)15</b></p><p>　　摘要：本文以烏賊眼為原料，以透明質(zhì)酸提取率為指標(biāo)，采用單酶法研究了從烏賊眼液中提取透明質(zhì)酸的工藝。研究結(jié)果表明，胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三種蛋白

9、酶中，中性蛋白酶的酶解效率最高。選取中性蛋白酶進(jìn)行了單因素試驗，以酶解溫度、酶解時間、加酶量、pH值作為試驗因素，初步確立了中性蛋白酶酶解的各水平最佳條件。最后，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化確定了中性蛋白酶酶解提取烏賊眼中透明質(zhì)酸的最佳工藝條件：酶解時間3.09h，酶解溫度60.57 ℃，加酶量為8239.95U/g。通過實驗驗證，在該條件下，中性蛋白酶對提取透明質(zhì)酸有較好的酶解效果，其透明質(zhì)酸提取率為10.69%，與模型預(yù)測值相符。說明單酶法可

10、較好地應(yīng)用于烏賊眼中透明質(zhì)酸的提取，通過響應(yīng)面分析法可以得到一個較好預(yù)測試驗結(jié)果的模型方程。</p><p>　　關(guān)鍵詞：烏賊眼睛；透明質(zhì)酸；酶法；提?。豁憫?yīng)面分析法　</p><p>　　Abstract ： In this paper, with the extraction rate of hyaluronic acid as the index, squid eyedrops of

11、 hyaluronic acid was extracted from squid eyes by using enzymatic hydrolization. Study results showed that, neutral protease selected for maximum efficiency from pepsin, neutral protease and trypsin these three protease.

12、Has chosen neutral protease carrying on single factor test, with enzynolysis temperature, enzynolysis time, plus enzyme quantity and pH value, as the experimental factor, have est</p><p>　　Keywords： Squid ey

13、es; Hyaluronic acid (HA) ; Enzymatic;extraction; Response surface method (RSM)</p><p><b>　　0 前言</b></p><p>　　烏賊，俗稱墨魚,是我國四大海產(chǎn)(大黃魚、小黃魚、帶魚、烏賊)之一，是沿海常見的一種產(chǎn)量很高的軟體動物，肉厚味美, 營養(yǎng)豐富, 具有重要的經(jīng)濟(jì)價值與

14、藥用價值。</p><p>　　目前，人們對烏賊的利用與開發(fā)主要為其骨、肉、墨、血、卵及內(nèi)臟。烏賊骨又名海螵蛸，是一種常用的中藥材， 可治多種內(nèi)外出血, 單用有效表現(xiàn)為制酸, 可中和過多胃酸[1],在皮膚、粘膜包括體內(nèi)表面還有制泌、收斂、降低血管通透性的作用, 化學(xué)處理過的海螵蛸還可用作接骨材料,相容性好且不引起炎癥、毒性及排斥反應(yīng)[2]，并且還有抗腫瘤、防輻射的功效。烏賊肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)豐富,有活血化淤之效,

15、不但補(bǔ)氣、補(bǔ)血且可滋陰[3]。烏賊墨在我國最初用于止血,當(dāng)今對其的研究包括增強(qiáng)對細(xì)胞免疫功能及抗腫瘤功能，以及提取物制毛發(fā)強(qiáng)壯劑,用于生發(fā)、黑發(fā)[1]。烏賊血可主治耳聾。烏賊卵可用于開胃利水[1]，烏魚蛋是雌墨魚的纏卵腺加工制成的，有冬食去寒夏食解熱之功效。烏賊內(nèi)臟粉蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成較理想，除具備必需氨基酸外，還含有豐富的?；撬幔缓蚜字湍懝檀?，可作為對于甲殼類動物的的飼料[4]。</p><p>　

16、　然而烏賊頭兩側(cè)一對發(fā)達(dá)的眼睛，卻沒有得到很好的利用。據(jù)統(tǒng)計，水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生大約15%~40%的下腳料，其中魚眼約占2%~5%，通常這些下腳料(包括烏賊眼)會被人們忽視。烏賊眼較大，如果對其加以利用，從中提取具有廣泛應(yīng)用的透明質(zhì)酸，不僅能豐富我們對烏賊的開發(fā)利用，同時能帶動水產(chǎn)品的加工利用，減少漁業(yè)資源浪費(fèi)，而且提取出的透明質(zhì)酸，能應(yīng)用于人們的日常生活之中，提高人們的生活質(zhì)量。</p><p>　　透明質(zhì)酸

17、(Hyaluronic acid ,簡稱HA),又名玻璃酸,玻尿酸,它是由(1 - 3) 2 -乙酰氨基-2 -脫氧-D -葡萄糖(1 - 4)-D -D -葡萄醛酸雙糖重復(fù)單位所組成的直鏈粘多糖[5]。HA具有許多天然粘多糖共有的性質(zhì)，呈白色，無定形固體，無嗅、無味，有吸濕性，溶于水，不溶于有機(jī)溶劑[6]。HA最突出的特點(diǎn)是水溶液有獨(dú)特的黏彈性，由于透明質(zhì)酸含多個羥基、羧基, 能與水分子形成氫鍵, 有很強(qiáng)的保水作用,是國際上公認(rèn)的最好

18、的保濕劑[7]。</p><p>　　HA廣泛存在于動物的各種組織中, 其中以哺乳動物體內(nèi)的玻璃體、關(guān)節(jié)滑液和臍帶、雞冠含量最高[8]。1934 年Meyer 和Palmer首先從牛眼玻璃體內(nèi)提取分離得到該物質(zhì)。此后，人們對HA 的分布、化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生理作用、制備工藝及其應(yīng)用方面進(jìn)行了廣泛深入的研究，在醫(yī)藥、化妝品、食品領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[9]。</p><p>　　因HA化學(xué)結(jié)構(gòu)具有

19、單糖間氫鍵的作用和螺旋空間外側(cè)具有疏水性，HA具有很強(qiáng)的保水性，成膜性和潤滑性[10]。HA具有抗氧化功能，通過與自由基的反應(yīng),HA 在體內(nèi)可成為消除自由基的清道夫[11]。因而，HA現(xiàn)已廣泛地用在基礎(chǔ)化妝品品--乳劑、霜劑、化妝水、美容液、潤膚等;婦女用化妝品--底霜、口紅、唇青、眼瞼膏、粉餅、描眉脂等和各類香波、發(fā)乳等日化產(chǎn)品中。目前含透明質(zhì)酸的化妝品被國際上公認(rèn)為“ 第四代化妝品” 、“ 仿生化妝品”等, 許多國家在競相研究開發(fā)[

20、8]][8]38的。</p><p>　　HA還應(yīng)用于醫(yī)學(xué)美容中，一是對皮膚科的應(yīng)用， HA能用來治療皮膚炎癥，促進(jìn)組織的再生、重塑和愈合過程中，對肌膚進(jìn)行再生性修復(fù)，不留疤痕；二是透明質(zhì)酸作為皮膚填充劑用于注射美容 [12]。</p><p>　　在眼科手術(shù)，HA具有保護(hù)角膜上皮，維持角膜透明，維護(hù)正常前房，保護(hù)眼內(nèi)組織，協(xié)助散瞳，防止玻璃體脫出，幫助止血，支撐囊袋，潤滑縫線等作用，故廣

21、泛用于穿透性角膜移植術(shù)、抗青光眼術(shù)、白內(nèi)障超聲乳化吸出術(shù)、人工晶體取除術(shù)、玻璃體視網(wǎng)膜術(shù)、眼外傷等各項眼科復(fù)雜手術(shù)[6]。HA對骨性關(guān)節(jié)炎(OA)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等關(guān)節(jié)疾病的治療效果明確、安全，具有很好的應(yīng)用前景[13]。黃建艷等[14]制備成瓊脂糖一HA共聚物，再用該共聚物包載胰島素，釋藥實驗表明包載的胰島素具有緩釋行為；Lee等[15] 研制出一種HA一紫杉醇結(jié)合物，它在水溶液中可形成納米級膠束聚集體，且在酸性條件下紫杉醇可

22、完整地從膠束中解離，具有靶向性和控釋作用，作為特異性腫瘤拮抗劑具有潛在的應(yīng)用前景；Kumar等[16]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2O3可以作為將HA 與納米粒連接的“橋梁”，并成功地研制出新型HA—Fe2O3 納米級脂質(zhì)體，同時發(fā)現(xiàn)這種新型脂質(zhì)體幾乎能夠全部將多肽藥物輸送至靶點(diǎn)。此外，作為診斷某些疾病的指標(biāo),Maria、Polyxeni等人研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸（HA）在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了顯著的作用，通過比濁法測量201個地</p>

23、<p>　　因此，本課題以透明質(zhì)酸得率為指標(biāo)，確定溫度、PH、加酶量以及酶解時間對中性蛋白酶水解提取烏賊眼中透明質(zhì)酸的影響，采用響應(yīng)面法優(yōu)化中性蛋白酶的酶解條件，確定最佳酶解工藝，對透明質(zhì)酸的研究與烏賊的開發(fā)利用具有重要的意義！</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>　　1.1實驗材料與儀器</p><p&

24、gt;<b>　　1.1.1原料</b></p><p>　　烏賊眼：新鮮金烏賊購于寧波莊市 </p><p>　　新鮮金烏賊洗凈，挑破眼珠，取眼液，濾去泥沙、色素等雜質(zhì)，-18℃凍藏；實驗用時4℃解凍，勻漿。</p><p><b>　　1.1.2實驗試劑</b></p><p>　　中性蛋白

25、酶 （20萬U/g）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、D-葡萄糖醛酸、葡萄糖、蒽酮-硫酸試劑、咔唑、十水合四硼酸鈉（四硼酸鈉）（分析純）、氯化鈉（分析純）、雙氧水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%）、濃硫酸、無水酒精（分析純）、三氯乙酸（15%）</p><p>　　1.1.3儀器與設(shè)備</p><p>　　電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；</p>&l

26、t;p>　　DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；</p><p>　　冷凍高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；</p><p>　　T6-新銳可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；</p><p>　　SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器 金壇市科技儀器有限公司；

27、</p><p>　　ZJ1U1—1型恒溫干燥箱 浙江諸暨市實驗儀器廠。 </p><p>　　凱氏定氮裝置，消化爐，馬福爐等。</p><p><b>　　1.2 實驗方法</b></p><p>　　1.2.1 烏賊眼玻璃體基本成分測定</p><p>　　1.2.1.1

28、水分測定:直接干燥法（GB/T5009.3—2010） </p><p>　　1.2.1.2 灰分測定：灰化法 （GB/T5009.4—2010）</p><p>　　1.2.1.3 總蛋白測定：凱氏定氮法法（GB/T5009.5—2010）</p><p>　　1.2.1.4 總糖測定：蒽銅硫酸法</p><p>　　樣品處理：稱取一定量勻

29、漿后樣品，加適量的水于90℃ 水浴提取3 h，將提取液稀釋一定倍數(shù)后備用。</p><p>　　標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：分別移取0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL、8 mL、10 mL濃度1 g/L 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液于100 mL容量瓶定容，即得濃度為0.005 g/L、0.01 g/L、0.02 g/L、0.05 g/L、0.08 g/L、0.10 g/L葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取蒸餾水、葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)液各1 g/L

30、，加入4 g/L蒽酮-硫酸試劑搖勻，迅速將試管放入冰水浴中冷卻，避光處存放，各管加完后一起放入沸水浴中加熱，自水浴重新沸騰起加熱7 min，流動水冷卻，室溫放置10 min，在620 nm波長處比色測定。</p><p>　　樣品測定：同標(biāo)準(zhǔn)品的處理，記錄吸光值A(chǔ)。</p><p>　　1.2.2 酶活力的測定—福林（Folin）法</p><p>　　試劑配制：（

31、1）福林試劑(Folin試劑)：于2000mL磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100 g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g，蒸餾水700mL，85%磷酸50mL，濃鹽酸100mL，文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸鋰(Li2SO4)50g，蒸餾水50mL，混勻，加入幾滴液體溴，再煮沸15min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴溴液，再煮沸除去之。冷

32、卻后，定容至1000mL，用細(xì)菌漏斗過濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。（2）0.4 mol碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4 g，定容至1000 mL。（3）0.4 mol三氯乙酸(T C A)溶液：稱取三氯乙酸(CCl3COOH) 65.4 g，定容至1000 mL。pH 7.2磷酸鹽緩沖液： 稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 31.2 g，定容至1000

33、mL，即成0.2 mol溶液(A液)。稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mo</p><p>　　酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：</p><p>　　分別吸取不同濃度酪氨酸1 mL，各加入0.4 mol碳酸鈉5 mL，再各加入已稀釋的福林試劑1 mL。搖勻置于水浴鍋中。40 ℃保溫發(fā)色20 min在660 nm波長測OD值。一般

34、測三次，取平均值，同時做空白試驗。</p><p><b>　　樣品測定：</b></p><p>　　稱取酶粉0.100 g，加入pH 7.2磷酸鹽緩沖液定容至100mL，吸取此液5 mL，再用緩沖液稀釋至25 mL，即成5000倍的酶粉稀釋液。取樣品稀釋液1 mL，置于40 ℃水浴中預(yù)熱2 min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min，時間到后

35、，立即再各加入0.4 mol三氯乙酸2 mL，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過濾，然后另取濾液1 mL，再加0.4 mol碳酸鈉5 mL，已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20 min后進(jìn)行光密度(OD)測定?？瞻自囼灉y定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白。</p><p>　　計算：在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)

36、生1μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。</p><p>　　樣品蛋白酶活力單位(干基) = ×4×N×</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　A —由樣品測得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K)；</p><p>　　4 —4 mL反

37、應(yīng)液取出1 mL測定(即4倍)；</p><p>　　N —酶液稀釋的倍數(shù)；</p><p>　　10 —反應(yīng)10 min；</p><p>　　W —樣品水分百分含量。</p><p>　　1.2.3 透明質(zhì)酸含量測定</p><p>　　關(guān)于透明質(zhì)酸含量的測定，有咔唑法【18】和濁度試驗法【19】，前者利用結(jié)合或游

38、離的葡萄糖醛酸在濃硫酸中能夠與咔唑試劑反應(yīng)而生成有顏色的物質(zhì)原理，后者利用透明質(zhì)酸和十六烷基三甲基溴之間能形成不溶性復(fù)合物可以通過酶標(biāo)儀測定，Jung-Min Song等人最佳研究發(fā)現(xiàn)后者更簡便更快速，但是由于目前應(yīng)用的太少，故本實驗使用Bitter和Muir建立的改良咔唑法，通過測定葡萄醛酸的方法，選用直接比色法進(jìn)行測定透明質(zhì)酸的含量【18】。一般葡萄糖醛酸約占透明質(zhì)酸質(zhì)量的48.44%，根據(jù)換算可得出透明質(zhì)酸的含量。</p&g

39、t;<p>　　試劑配制：（1）0.025mol/L硼砂硫酸液：稱取四硼酸鈉9.45g，溶于濃硫酸(AR)1000ml中,加蓋,不定時振搖,直至四硼酸鈉完全溶解。室溫下貯存。（2）0.1%咔唑試液：稱取咔唑0.125g，溶于乙醇(AR)100ml中,置于棕色瓶中冰箱內(nèi)保存。（3） 葡萄糖醛酸（GA）標(biāo)液：精稱20mg葡萄糖醛酸，置于100ml容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，4℃以下貯存。</p><p>

40、;　　葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作： </p><p>　　精密稱取葡糖醛酸(AR)20mg，置100ml量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻備用。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，分別加入10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，得10、20、30、40和50μg/ml濃度的對照品溶液。取6只具塞刻度試管分別加入硼砂硫酸液5ml，置冰浴中冷至4℃左右。然后分別取空白溶液(蒸餾水)和不同濃度的對照品溶液各1ml

41、加入試管中，先輕輕振搖，再充分混勻，并不斷用冰浴冷卻，將試管置沸水中加熱10min，置常水中冷至室溫。加入咔唑試劑0.2ml，混勻，水浴中再加熱15min，冷至室溫。在530nm處測定吸收度Ａ，以吸收度對濃度Ｃ作圖即可繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,或作直線回歸數(shù)據(jù)處理,計算出吸收度和濃度的線性回歸方程:C=b+kA，b－截距，k－斜率。</p><p>　　圖1.葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖</p><p>　　

42、Fig 1. Standard curve of glucuronic acid</p><p>　　所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y =0.0129x – 0.0153, 相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9958,其中: y為吸光度; x為葡萄糖醛酸濃度(ug/ml) ,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。</p><p><b>　　樣品測定：</b></p><p>　　

43、取本品0.1g/L的溶液1ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法測定吸收度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的葡糖醛酸濃度，按下式計算含量： 透明質(zhì)酸提取率=透明質(zhì)酸含量（g）/玻璃體干重（g）×100％</p><p>　　1.2.4 工藝流程</p><p>　　烏賊眼→破眼珠取眼液→鹽溶處理→調(diào)PH→加酶→保溫酶解→滅酶→離心→TCA（三氯乙酸）去蛋白 →H2O2脫色→醇沉→冷凍干燥→透明質(zhì)酸粗品

44、</p><p>　　1.2.5 操作要點(diǎn)</p><p>　　1.2.5.1原料預(yù)處理</p><p>　　將新鮮的烏賊洗凈，剪下烏賊頭部，然后將烏賊的眼從眼眶中挑出來，挑的時候注意不要將烏賊眼珠挑破，挑出來后用干凈的剪刀將其戳破（烏賊眼珠置于干凈的小燒杯內(nèi)），去除眼中的晶狀體，將眼中的紅褐色眼液滴入干凈的小燒杯內(nèi)。等所有烏賊眼珠都處理完后，濾去泥沙、色素等雜質(zhì)，

45、將其盛放于干凈小燒杯中并用保鮮膜封口并用橡皮筋圈住，貼上標(biāo)簽，置于冰箱冷凍室中貯存以備用。</p><p>　　1.2.5.2鹽溶處理</p><p>　　按料液比1:5在烏賊眼液中加入0.2mol/L氯化鈉溶液，于SHZ-82 氣浴恒溫振蕩器內(nèi)振搖4h。</p><p>　　調(diào)節(jié)溶液PH時，先測定原液的PH,再在這基礎(chǔ)上用1mol/L的NaOH 和1mol/LHC

46、l溶液調(diào)節(jié)。</p><p><b>　　1.2.5.3酶解</b></p><p>　　在酶解之前，先調(diào)節(jié)好所用水浴鍋的溫度。將已經(jīng)加入酶的溶液振蕩均勻，將其放入水浴鍋中進(jìn)行保溫酶解，注意固定好錐形瓶，每隔20min左右，振蕩均勻錐形瓶內(nèi)溶液，使其充分反應(yīng)。</p><p><b>　　1.2.5.4滅酶</b><

47、/p><p>　　將酶解好后的溶液取出，放盛放有沸水的鍋內(nèi)煮沸10min進(jìn)行滅酶處理。在該過程中要注意水量要適中，水量過多錐形瓶會漂浮不容易固定，而且所貼的標(biāo)簽也會脫落，可能會使各樣品難以區(qū)別；水量過少，則水容易燒干。</p><p><b>　　1.2.5.5離心</b></p><p>　　滅酶后搖勻?qū)悠返谷敫蓛舻臉?biāo)好號的離心管內(nèi)，于離心機(jī)內(nèi)

48、6000r/min離心8min。</p><p>　　1.2.5.6 TCA（三氯乙酸）去蛋白</p><p>　　取離心后的上清液，加入2倍體積的15% 的TCA，靜置0.5h后于4000 r/min離心20min.。</p><p>　　1.2.5.7 H2O2脫色</p><p>　　取離心后的上清液，將其PH調(diào)至中性,再加入10%體積

49、的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水脫色4h。</p><p><b>　　1.2.5.8醇沉</b></p><p>　　脫色好后,盡快加入3.5-4倍體積的95%的乙醇進(jìn)行醇沉,將其置于4℃冰箱內(nèi)過夜,隔天離心過濾取沉淀。</p><p>　　1.2.6酶解工藝單因素實驗</p><p>　　1.2.6.1酶種類的選擇<

50、/p><p>　　將胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶三種蛋白酶，依據(jù)各自的酶活力確定加酶量，并在各自最佳酶解條件下酶解烏賊眼液，根據(jù)透明質(zhì)酸得率的多少，確定最佳的酶解蛋白酶。</p><p>　　1.2.6.2加酶量的確定</p><p>　　在樣液中分別加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%（w/v）選定的最佳蛋白酶

51、,與40℃下酶解2h,然后測溶液的吸光度,計算出透明質(zhì)酸得率,從而得出最適合的加酶量。</p><p>　　1.2.6.3 酶解時間的確定</p><p>　　對于選定的最佳蛋白酶,在相同的酶解條件下進(jìn)行酶解, 選用不同的水解時間,0.5h、1h、2h、3h、4h、5h，根據(jù)最后透明質(zhì)酸的得率,確定最佳的酶解時間。</p><p>　　1.2.6.4 酶解溫度的確定

52、</p><p>　　對于選定的最佳蛋白酶,在其他條件相同的酶解條件下,分別于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下水解2h,然后通過測定結(jié)果確定最佳酶解溫度。</p><p>　　1.2.6.5 酶解PH的確定</p><p>　　對于選定的最佳蛋白酶,在其他條件相同的酶解條件下,分別調(diào)節(jié)其PH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和維持原溶液PH進(jìn)行

53、酶解，根據(jù)最后透明質(zhì)酸的得率,確定最佳的酶解PH。</p><p>　　1.2.7 酶解相應(yīng)面試驗分析</p><p>　　根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗設(shè)計原理[20]，綜合單因素影響實驗結(jié)果，選取對透明質(zhì)酸提取率影響顯著的三個因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行試驗設(shè)計，對酶解提取烏賊眼中透明質(zhì)酸的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。</p><

54、;p><b>　　2 結(jié)果與分析</b></p><p>　　2.1烏賊眼液中基本成分測定</p><p>　　本實驗得按照最新國家標(biāo)準(zhǔn)對烏賊眼液中的基本成分進(jìn)行了測定，經(jīng)過設(shè)定平行試驗與多次測量取平均值，最后獲得各基本成分的含量，如表1所示。從表1可知，烏賊眼中含量最多的成分是水分，其次是總糖的含量，包括本次實驗要測定的透明質(zhì)酸粘多糖，此外烏賊眼中還含有一定量

55、的蛋白質(zhì)。</p><p>　　表 1.烏賊眼液中基本成分含量</p><p>　　Table 1. The basic component content in squid eyedrops</p><p>　　2.2 酶種類的選擇</p><p>　　2.2.1酶活力測定</p><p>　　所得酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸

56、方程為：y =0.0115x +0.0095, 相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9987,其中: y為吸光度; x為酪氨酸濃度(ug/ml) ,標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。</p><p>　　圖2.酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Fig 2.Standard curve of enzyme activity</p><p>　　根據(jù)福林（Folin）法操作說明與酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線，測

57、得胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶三種酶的酶活力如表2所示。</p><p>　　表2.不同種類酶的酶活力</p><p>　　Table 2. different types of enzyme activity</p><p>　　2.2.2酶種類的確定</p><p>　　選用胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶三種非常常見的蛋白酶，根據(jù)各自的

58、最佳酶解條件，胃蛋白酶酶解條件為料液比1：3，加酶量8000U/g，PH2.0,于37℃下酶解2.0h；中性蛋白酶酶解條件為料液比1：3，加酶量8000U/g，PH7.0,于40℃下酶解2.0h[21]；胰蛋白酶酶解條件為料液比1：3，加酶量8000U/g，PH8.0,于40℃下酶解2.0h。酶解好后,各種酶酶解透明質(zhì)酸得率如表2所示。</p><p>　　表3.不同種類酶對透明質(zhì)酸得率的影響</p>

59、<p>　　Table 3. different kinds of enzymes on the yield of hyaluronic acid</p><p>　　由表3可以得知，用中性蛋白酶酶解烏賊眼液的透明質(zhì)酸提取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于使用胃蛋白酶和胰蛋白酶的透明質(zhì)酸提取率，故選擇中性蛋白酶作為最適蛋白酶進(jìn)行酶解。</p><p>　　2.3 加酶量對透明質(zhì)酸提取率的影響<

60、/p><p>　　選取中性蛋白酶進(jìn)行實驗，在T = 40℃條件下，按料液比1:5加入0.2mol/L氯化鈉溶液，SHZ-82氣浴恒溫振蕩器中振蕩4h，振蕩結(jié)束后，分別按2000 U/g、3000 U/g、4000 U/g、5000 U/g、6000 U/g、7000 U/g、8000 U/g、9000 U/g、10000 U/g（w/v）加入中性蛋白酶，都酶解2h后，得出透明質(zhì)酸提取率，結(jié)果如圖3所示。</p&

61、gt;<p>　　圖3.加酶量對透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　Figure 3. enzyme concentration on the extraction rate of hyaluronic acid</p><p>　　從圖3中可以看出，隨著酶用量的加大，透明質(zhì)酸的提取率不斷增大，特別是加酶量從2000 U/g到8000 U/g之間，透明質(zhì)酸提取率顯著增加

62、，上升趨勢較快，在加酶量為8000 U/g到10000 U/g之間，透明質(zhì)酸提取率增加得比較緩慢，趨勢漸緩，幾乎持平。估計在加酶量為8000 U/g時，烏賊眼液中的透明質(zhì)酸幾乎都已經(jīng)被酶解釋放出來了，考慮到酶解效果與實際成本，8000 U/g應(yīng)為最佳加酶量。</p><p>　　2.4酶解時間對透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　在T = 40℃條件下，按料液比1:5加入0.2mol

63、/L氯化鈉溶液，SHZ-82氣浴恒溫振蕩器中振蕩4h，振蕩結(jié)束后，加入8000 U/g（w/v）中性蛋白酶，分別酶解0.5h、1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h后，得出其透明質(zhì)酸提取率，結(jié)果如圖4所示。</p><p>　　圖4.酶解時間對透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　Figure 4. hydrolysis time on extraction yield of

64、 hyaluronic acid</p><p>　　從圖4可以看出，透明質(zhì)酸提取率先隨著時間的增加而增大，在3.0h左右達(dá)到最大值，在3.0h以后，透明質(zhì)酸提取率反而減小，可能由于時間的延長，部分透明質(zhì)酸在溶液中發(fā)生了降解發(fā)應(yīng)，導(dǎo)致其提取率在3.0h后不增反減。根據(jù)透明質(zhì)酸提取率的最大值，將最佳酶解時間定為3.0h。</p><p>　　2.5 酶解溫度對透明質(zhì)酸提取率的影響</p

65、><p>　　先按料液比1:5加入0.2mol/L氯化鈉溶液，SHZ-82氣浴恒溫振蕩器中振蕩4h，振蕩結(jié)束后，加入8000 U/g（w/v）中性蛋白酶，分別于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴鍋中，酶解2.0h，得出其透明質(zhì)酸提取率，結(jié)果如圖5所示。</p><p>　　從圖5可以看出，酶解溫度對透明質(zhì)酸提取率的影響是顯著的，透明質(zhì)酸提取率先隨著溫度的增加而增大，在60℃左右

66、達(dá)到最大值，在60℃以后，透明質(zhì)酸提取率反而減小?？赡苡捎跍囟鹊脑黾樱糠种行缘鞍酌赴l(fā)生了變性，也可能隨著溫度增加透明質(zhì)酸發(fā)生了降解，從而導(dǎo)致其提取率在60℃后不增反減。根據(jù)透明質(zhì)酸提取率的最大值，將最佳酶解溫度定為60℃。</p><p>　　圖5.酶解溫度對透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　Figure 5. enzymatic extraction temperature o

67、n the rate of hyaluronic acid</p><p>　　2.6 pH對透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　在T = 40℃條件下，按料液比1:5加入0.2mol/L氯化鈉溶液，于SHZ-82氣浴恒溫振蕩器中振蕩4h，振蕩結(jié)束后，按8000 U/g（w/v）加入中性蛋白酶，先用PH計測出未調(diào)PH值前原液PH為6.6，用1mol/L的NaOH 和1mol/LHCl

68、溶液調(diào)節(jié)pH，將樣品溶液PH分別調(diào)為PH6.0、PH6.5、PH7.0、PH7.5和PH8.0，酶解2h后，得出透明質(zhì)酸提取率，結(jié)果如圖6所示。</p><p>　　從圖6可以看出，透明質(zhì)酸提取率先隨著PH的增加而增大，在PH6.6左右達(dá)到一個峰值，隨后透明質(zhì)酸提取率反而有些微減小，在PH7.0以后透明質(zhì)酸提取率又隨著PH的增加而增大，在PH7.5左右達(dá)到另一個峰值，然后隨著PH的增加透明質(zhì)酸提取率反而降低。在本

69、次實驗中，透明質(zhì)酸提取率出現(xiàn)了兩個峰值，分別為PH6.6時6.69%的和PH7.5時的6.71%，兩者相差不大，考慮到操作成本與便利性，其最佳酶解PH值即為原液的PH值。</p><p>　　圖6.酶解pH值對透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p>　　Figure 6. enzymatic pH value on the extraction rate of hyaluronic acid

70、</p><p>　　2.7 酶解條件的優(yōu)化</p><p>　　根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計試驗，以酶解時間、酶解溫度、加酶量為自變量，透明質(zhì)酸提取率為響應(yīng)值。對酶解時間、酶解溫度、加酶量作如下變換[22]：A=(T－3.0)/0.5，B=(t－60.0)/5，C=(z－8000)/1000，以三次試驗所得多糖提取率的平均值為響應(yīng)值(Y)，選取的水平表如表4所示。采用Design-

71、Expert ® v.7軟件設(shè)計試驗并處理數(shù)據(jù)。</p><p>　　表4.響應(yīng)面試驗因素水平</p><p>　　Table 4. Factors and levels of RAS test</p><p>　　2.7.1優(yōu)化試驗結(jié)果方差分析</p><p>　　對酶解時間、酶解溫度、加酶量與透明質(zhì)酸提取率進(jìn)行相應(yīng)面分析，試驗結(jié)

72、果見表5。對每個試驗點(diǎn)重復(fù)3次，取平均值。</p><p>　　表 5. 響應(yīng)面試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理</p><p>　　Table 5. Program and results of RSA test</p><p>　　對各個實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表6所示。</p><p>　　表 6. 回歸模型方差分析表</p>

73、<p>　　Table 6．Variance analysis of regression model</p><p>　　從表中可以看出模型F值為2854.15，該模型整體為顯著水平，表明回歸模型與試驗結(jié)果數(shù)據(jù)吻合良好。只有0.01%的機(jī)會，模型的F值由于噪音干擾會發(fā)生擴(kuò)大。Prob > F 值小于0.0500時，表明總體上模型因素水平項顯著?；貧w模型各項的方差分析結(jié)果表明酶解溫度的一次項A、加

74、酶量的一次項C、酶解時間和加酶量的交互項BC, 酶解溫度的二次項A2，酶解時間的二次項B2，加酶量的二次項C2項也均為顯著項，當(dāng)值大于0.1000則表明該模型因素水平不顯著。</p><p>　　如果含有許多不顯著的模型（不包括那些需要支持層次結(jié)構(gòu)的模型），那么這些模型階降將會提高本模型。失擬項的F值為4.73表明有8.37%的幾率模型的失擬項值會由于噪音干擾會發(fā)生擴(kuò)大。</p><p>

75、　　利用Design-Expert ® v.7軟件對表中透明質(zhì)酸提取率Y和三個因素A、B、C的數(shù)值進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程（1）。</p><p>　　Y%=10.66+0.14*A-0.026*B+0.95*C-0.038*A*B+0.025*A*C+0.27*B*C-0.38*A2-0.14*B2-2.05*C2 （1）</p><p>　　方差分析結(jié)果顯示, 回歸模型極

76、顯著( P<0.0001) ,表明試驗設(shè)計可靠。預(yù)測R的平方值為0.9965與調(diào)整R的平方值0.9994相比較是科學(xué)合理的?！癆deq精度”措施信號的信噪比，大于4是可取的。本模型為141.403，表明是適當(dāng)比例的信號。該模型擬合程度良好,該模型能夠很好地描述試驗結(jié)果,試驗誤差小,可用該模型來分析和預(yù)測酶法提取烏賊眼中透明質(zhì)酸的工藝結(jié)果[23]。采用因素重要性分析方法，對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，三因素的回歸平方和分別為SSA=596.62，

77、SSB=78.00，SSC=17046.63，表明因素的重要性順序為C>A > B，即加酶量 >酶解時間 >酶解溫度[24]。原因可能在于中性蛋白酶酶解時的適用酶解時間范圍較大，在試驗的酶解時間內(nèi)，其酶解程度比較穩(wěn)定，與前面的單因素試驗結(jié)果一致。</p><p>　　2.7.2響應(yīng)面直觀分析及酶解工藝的優(yōu)化</p><p>　　通過多元回歸方程作響應(yīng)面可以直觀表現(xiàn)出

78、各反應(yīng)條件對透明質(zhì)酸提取率的影響。固定一個因素于0水平，求另兩個因素的交互效應(yīng)方程，根據(jù)這些方程得到三個因子（酶解時間A，酶解溫度B，加酶量C）的交互效應(yīng)等高線圖和曲面圖。</p><p>　　圖7～圖9是根據(jù)多元回歸方程所得到的不同因素水平對烏賊眼中透明質(zhì)酸提取率影響的響應(yīng)面及其等高線圖，通過以下組圖可對任意兩因素及其交互作用對透明質(zhì)酸提取率的效應(yīng)進(jìn)行分析和評價，因而可以確定最佳因素水平范圍[22]。</

79、p><p>　　圖 7. Z=f(A,B)的響應(yīng)面與等值線</p><p>　　Fig 7. Responsive surface plot and contour plot Z=f(A,B)</p><p>　　圖7是加酶量固定為8000 U/g時，酶解時間與酶解溫度對透明質(zhì)酸提取率的響應(yīng)面及其等高線圖。通過圖7可以比較直觀地看出，酶解時間與酶解溫度的交互作用對透明質(zhì)

80、酸提取率結(jié)果的影響是顯著的，透明質(zhì)酸提取率隨酶解時間和酶解溫度先增加后減小，在酶解時間為3.0h，酶解溫度為60.0℃ 時，透明質(zhì)酸提取率達(dá)到最大值10.67%。其原因可能為隨著時間的增加，透明質(zhì)酸糖鍵結(jié)構(gòu)可能在中性蛋白酶的作用下不夠穩(wěn)定發(fā)生了化學(xué)變化，部分透明質(zhì)酸降解導(dǎo)致透明質(zhì)酸提取率下降。從等高線圖上可以看出，實驗范圍內(nèi)酶解時間較長時等高線趨向圓形排列較松散，說明交互作用較弱[22]，對透明質(zhì)酸提取率影響不顯著。酶解時間較短時等高線

81、趨向橢圓，表明交互作用較強(qiáng)[22]，對透明質(zhì)酸提取率影響顯著。</p><p>　　圖 8. Z=f(A,C)的響應(yīng)面與等值線</p><p>　　Fig 8. Responsive surface plot and contour plot Z=f(A,C)</p><p>　　圖8是酶解溫度60.0℃時，加酶量與酶解時間對透明質(zhì)酸提取率的響應(yīng)面及其等高線圖。由圖

82、可知，隨著隨著加酶量的增加透明質(zhì)酸提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢。觀察等高線可以看出，加酶量在7000-8000U/g之間時，等高線較密集，交互作用較強(qiáng)，表明對透明質(zhì)酸提取率影響顯著。而當(dāng)加酶量在8000-9000U/g之間時，等高線較稀疏，交互作用較弱，表明對透明質(zhì)酸提取率影響不顯著。該結(jié)果與單因素實驗結(jié)果相一致，這可能是因為加酶量在8000U/g左右時，中性蛋白酶幾乎已經(jīng)提取完了樣液中的透明質(zhì)酸，提取率已經(jīng)達(dá)到飽和，再加入中性蛋白酶透明質(zhì)

83、酸提取率不會增大反而會由于中性蛋白酶過量引起部分透明質(zhì)酸降解而使透明質(zhì)酸提取率降低。</p><p>　　圖 9. Z=f(B,C)的響應(yīng)面與等值線</p><p>　　Fig 9. Responsive surface plot and contour plot Z=f(B,C)</p><p>　　圖9是酶解時間為3.0h時，加酶量與酶解溫度對透明質(zhì)酸提取率的響

84、應(yīng)面及其等高線圖。由圖9可見，隨著酶解溫度的增加透明質(zhì)酸提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。在酶解溫度中心值附近時，這種變化趨勢最為明顯，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面較陡，表明加酶量對透明質(zhì)酸提取率影響顯著（p<0.05）；隨著酶解溫度降低或進(jìn)一步增高，這種變化趨勢變緩，表現(xiàn)為響應(yīng)曲面趨于平滑，表明加酶量對透明質(zhì)酸提取率影響減弱。同樣，隨者加酶量的逐漸增加，透明質(zhì)酸提取率隨酶解溫度的變化趨勢呈現(xiàn)類似效應(yīng)。從等高線可以看出，在試驗范圍內(nèi)，溫度高時等高線

85、密集，間距較窄，對透明質(zhì)酸提取率影響顯著。溫度較低時等高線稀疏，間距較寬，對透明質(zhì)酸提取率影響不顯著。這可能因為一，中性蛋白酶在較低溫度下酶活性達(dá)到最高，透明質(zhì)酸提取率也相應(yīng)最高。隨著溫度的提高，酶活下降，透明質(zhì)酸提取率隨之下降。其二，高溫度下透明質(zhì)酸可能發(fā)生裂解反應(yīng)，也降低了透明質(zhì)酸提取率。</p><p><b>　　2.8 驗證試驗</b></p><p>　　

86、根據(jù)Design-Expert ® v.7軟件對透明質(zhì)酸提取率Y和三個因素A、B、C的數(shù)值進(jìn)行回歸分析得到回歸方程，通過對各個變量求偏導(dǎo)，得出各參數(shù)的最優(yōu)值為：A=3.09，B=60.57，C=8239.95。由此，可以得到酶法提取烏賊眼中透明質(zhì)酸的最佳工藝條件為酶解時間3.09h，酶解溫度60.57 ℃，加酶量8239.95U/g；在此工藝條件下，透明質(zhì)酸提取率的理論值可達(dá)10.7847%。</p><p

87、>　　為檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述最優(yōu)改性條件進(jìn)行酶法提取烏賊眼中透明質(zhì)酸實驗，同時考慮到實際操作的便利[25]，將最佳工藝參數(shù)修正為：酶解時間為3h，酶解溫度60 ℃，加酶量8200U/g，實際結(jié)果為10.69%，與理論預(yù)測值比較接近，表明實驗設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。</p><p><b>　　3 小結(jié)</b></p>

88、<p>　　本文以烏賊眼為原料，以透明質(zhì)酸提取率為指標(biāo)，采用單酶法研究了從烏賊眼液中提取透明質(zhì)酸的工藝。首先，選用胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三種工業(yè)應(yīng)用廣泛的蛋白酶，依據(jù)測定所得的各自酶活力確定加酶量，并在各自最佳酶解條件下酶解烏賊眼液，選取出酶解效率最高的中性蛋白酶為最佳蛋白酶。然后，進(jìn)行中性蛋白酶酶解單因素試驗，將酶解溫度、酶解時間、加酶量、pH值作為試驗因素，以透明質(zhì)酸提取率為指標(biāo)，初步確定了中性蛋白酶酶解烏賊眼液的

89、最佳酶解溫度為60 ℃，酶解時間3h，加酶量為8000U/g，最適pH為6.6（即原液pH）。最后，根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取酶解溫度、酶解時間、加酶量進(jìn)行了三因素三水平響應(yīng)面法試驗。</p><p>　　利用Design-Expert ® v.7軟件對試驗進(jìn)行設(shè)計與分析，通過響應(yīng)面圖直觀分析了各因素對透明質(zhì)酸提取率的影響，以及各因素之間對提取過程的交互影響。通過二次回歸設(shè)計，建立了響應(yīng)值（透明質(zhì)酸提取率

90、）與各因素之間的數(shù)學(xué)模Y%=10.66+0.14*A-0.026*B+0.95*C-0.038*A*B+0.025*A*C+0.27*B*C-0.38*A2</p><p>　　-0.14*B2-2.05*C2 ，該模型擬合良好。根據(jù)此二次回歸模型，確定酶法提取烏賊眼中透明質(zhì)酸最佳工藝參數(shù)：酶解時間3.09h，酶解溫度60.57 ℃，加酶量8239.95U/g。按照此工藝條件提取的透明質(zhì)酸提取率為10.69%，

91、與理論預(yù)測值10.7847%比較接近，表明實驗設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。同時，還得出酶法提取烏賊眼中透明質(zhì)酸時，三個因素影響大小順序為：加酶量 >酶解時間 >酶解溫度，在試驗范圍溫度內(nèi)，酶解溫度對透明質(zhì)酸提取率影響相對不敏感。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 楊曉燕, 賈福星. 烏賊的綜合藥用

92、[J] . 中國海洋藥物, 1999, (2) : 46-47.</p><p>　　[2] 劉藝, 王和鳴. 海螵蛸接骨動物實驗的組織學(xué)研究[J] . 中國中醫(yī)骨傷科, 1995, 3(5) : 6-8.</p><p>　　[3] 竇光宇. 亦真亦幻話烏賊[J] . 百科知識, 2007, (3) : 27-28.</p><p>　　[4] 劉智禹, 江

93、 琴. 烏賊內(nèi)臟粉的營養(yǎng)價值及其安全性研究[J] . 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2005, 20(4) : 271～274.</p><p>　　[5] 羅瑞明. 透明質(zhì)酸(HA) 的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀[J] . 寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2001, 22(1) : 62-64.</p><p>　　[6] 黃光斗, 趙宇, 張方櫻等. 透明質(zhì)酸的制備與應(yīng)用研究進(jìn)展[J] . 廣西輕工業(yè), 2002, (1

94、) : 24-26.</p><p>　　[7] 郭風(fēng)仙, 凌沛學(xué), 郭學(xué)平等. 透明質(zhì)酸的生理功能及其在化妝品和美容保健食品中的應(yīng)用[J] . 中國商辦工業(yè), 2002, 9: 45–46.</p><p>　　[8] 董學(xué)暢, 張淑桂. 透明質(zhì)酸的制備和應(yīng)用[J] . 云南化工, 1994, (2) : 38-40.</p><p>　　[9] 生舉正,

95、凌沛學(xué), 王鳳山. 透明質(zhì)酸生物合成的研究進(jìn)展[J] . 中國生化藥物雜志, 2009, 30(2) : 135-138.</p><p>　　[10] 杜平中. 透明質(zhì)酸的皮膚保健功能[J] . 中國生化藥物雜質(zhì), 1998, 19(5) : 283-284.</p><p>　　[11] 蘇志達(dá), 李瑜. 透明質(zhì)酸抗氧化作用的臨床應(yīng)用[J] . 南京軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2002，24(3

96、) : 174-176.</p><p>　　[12] 吳溯帆. 透明質(zhì)酸的基本知識和臨床應(yīng)用[J] . 現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué), 2010, 22(4) : 363-364.</p><p>　　[13] 王超, 張明春. 透明質(zhì)酸的制備及作為藥用材料方面的應(yīng)用進(jìn)展[J] . 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2009, 4(6) :4 52-454.</p><p>　　[14] 黃建

97、艷, 包磊, 毛萱等. 瓊脂糖一透明質(zhì)酸共聚物作為胰島素載體[J] . 材料科學(xué)與工程學(xué)報, 2009, 27(1) : 43—46.</p><p>　　[15] Lee H, Lee K, Park TG. Hyaiuronic acid—paclitaxel conjugate micelles：synthesis, characterization, and antitumor activit

98、y[J] . Bioconjug Chem, 2008, l9(6) : 1319—1325.</p><p>　　[16] Kumar A, Sahoo B, Montpetit A, etal. Development of hyaluronicacid—Fe203 hybrid magnetic nan oparticles for targeted delivery ofpeptides[J] .

99、 Nanomedicine, 2007, 3(2) : 132-137.</p><p>　　[17] Maria, Polyxeni etal. Evaluation of liver fibrosis in patients with thalassemia: The important role of hyaluronic acid[J] . Blood Cells, Molecules, and D

100、iseases, 2010, (45) : 215–218.</p><p>　　[18] 顧其勝, 嚴(yán)凱. 透明質(zhì)酸與臨床醫(yī)學(xué)[M].上海, 第二軍醫(yī)大學(xué)出版社, 2003.</p><p>　　[19] Jung-Min Song, Jong-Hyuk Im, Jae-Hoon Kang etal. A simple method for hyaluronic acid qu

101、antification in </p><p>　　culture broth[J] . Carbohydrate Polymers, 2009 , (78) : 633–634.</p><p>　　[20] 劉軍海, 黃寶旭, 蔣德超. 《響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝研究》[J] . 食品科學(xué), 2009, 30(02) : 114-118.</p><p

102、>　　[21] 秦乾安, 周小敏, 勵建榮. 魷魚眼提取透明質(zhì)酸去蛋白質(zhì)酶解工藝研究[J] . 食品工業(yè)科技, 2009, (1) : 214-218.</p><p>　　[22] 鐘葵, 王 強(qiáng). 響應(yīng)面法優(yōu)化龍眼多糖熱水浸提的工藝[J] . 化工進(jìn)展, 2010, 29 (4) : 739-744.</p><p>　　[23] 王明道, 原增艷,劉新育, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化

103、酶法提取懷地黃梓醇的工藝[J] . 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2010, 26 (1) :1 63-167.</p><p>　　[24] 劉石生, 林志鋒, 周國英等. 響應(yīng)面法優(yōu)化羅非魚肉內(nèi)源酶酶解工藝[J] . 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(1) : 85-88.</p><p>　　[25] 閆克玉, 高遠(yuǎn)翔. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化槐米總黃酮的提取工藝[J] . 食品研究與開發(fā), 2009,