雙酶法對烏賊眼中透明質(zhì)酸提取率的影響【開題報告+文獻綜述+畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　食品質(zhì)量與安全</b></p><p>　　雙酶法對烏賊眼中透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p><b>　　選題的背景與意義 </

2、b></p><p>　　透明質(zhì)酸是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元的高分子粘多糖，由相同的二糖單體質(zhì)量復排列而形成的無支鏈的直鏈多聚物，相對分子質(zhì)量在10~100萬之間 ，具有獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，它在有機體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，具有特殊的保水、保濕作用；分子量大的可成膜于皮膚表面，起到強的保濕、潤滑作用，分子量小的可滲入真皮層，促進血液循環(huán)、改善中間代謝，從而使皮膚光滑、

3、柔嫩 ，而且透明質(zhì)酸無致炎性及抗原性，是理想的“粘性手術(shù)”材料，對提高眼科、骨科手術(shù)效果起重要作用 ，所以被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥等方面。 </p><p>　　HA 廣泛分布于各種動物組織中，且不同的動物組織與細菌來源的透明質(zhì)酸無種屬差異 。迄今為止，已在結(jié)締組織、臍帶、人血清、雞冠、關(guān)節(jié)滑液、軟骨、眼玻璃體等組織中已分離得到HA。</p><p>　　目前，制備透明質(zhì)酸主要有兩種

4、途徑：一種是從動物組織中提取，一種是從微生物發(fā)酵液中提取 。國內(nèi)大多從雞冠、人臍帶、動物眼球等組織中提取透明質(zhì)酸。動物組織提取法所得的 HA 一般純度不夠高，而且生產(chǎn)效率低、成本高、原料來源受限制。雖然該法有上述缺點，但它仍然是當今生產(chǎn)醫(yī)用 HA主要的方法 。</p><p>　　以烏賊眼球為原料提取透明質(zhì)酸方面的研究在國內(nèi)未見報道，而烏賊眼睛是一類數(shù)量巨大的廢棄物，相對于其他魚眼較大，晶狀體所占體積也大。在水產(chǎn)

5、品加工過程中產(chǎn)生大約15%-40%的下腳料，其中魚眼約占2-5%，所以如何從廢棄的烏賊眼球中提取透明質(zhì)酸，進行科學的綜合利用，變廢為寶是一件非常有意義的事。本研究以烏賊魚眼為原料， 研究了烏賊眼透明質(zhì)酸的提取工藝，使烏賊資源得以合理開發(fā)利用，從而利于提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟附加值，變廢為寶。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題</p><p>　　本實驗的研究內(nèi)容包

6、括：</p><p>　　確定了最佳提取工藝：以透明質(zhì)酸得率為指標，通過單因素和響應(yīng)面試驗考察了酶解時間、pH值、酶解溫度、酶用量以及雙酶的加酶順序?qū)A提取率的影響，并優(yōu)化了工藝參數(shù)。</p><p>　　1、福林法對酶活性進行測定</p><p>　　2、氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸標準曲線的繪制</p><p>　　3、鏈霉菌蛋白酶水解時酶解

7、溫度、時間、pH、酶用量等的確定和優(yōu)化</p><p>　　4、鏈霉菌蛋白酶和中性蛋白酶進行復合水解</p><p><b>　　擬解決的問題：</b></p><p>　　酶解條件對HA提取率的影響</p><p><b>　　酶解條件的優(yōu)化</b></p><p>　　三

8、、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　1 資料檢索</b></p><p>　　以“透明質(zhì)酸”、“ 提取”、“ 酶法”、“ 復合酶法”等為檢索詞，檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（1989－2010）、CNKI數(shù)據(jù)庫（1989－2010） ，以“HA”、“hyaluronic acid ”、 “abstract ” 等為關(guān)鍵詞檢索Elsevier期刊(Scie

9、nceDirect) (1989－2010)查找相關(guān)文獻。</p><p><b>　　透明質(zhì)酸的提取</b></p><p>　　2.1葡萄糖醛酸含量測定</p><p>　　葡萄糖醛酸含量采用Bitter-Muir咔唑法測定，經(jīng)換算得到樣品中HA的含量。</p><p>　　2.2氨基葡萄糖含量測定</p>

10、;<p>　　氨基葡糖含量的測定參照Elson-Morgan法測定，以鹽酸氨基葡萄糖為標準品</p><p>　　2.3HA提取方法的確定及優(yōu)化</p><p>　　2.3.1預(yù)處理：冷凍烏賊眼里取出玻璃體液體，過濾除雜取濾液備用。</p><p>　　2.3.2鹽溶:取2g眼液，加入5倍體積0。2mol/L氯化鈉溶液，攪拌提取4h。</p>

11、;<p><b>　　2.3.3酶解</b></p><p>　　2.3.3.1雙酶水解及條件優(yōu)化</p><p>　　通過參考文獻選擇最適酶解烏賊眼液提取透明質(zhì)酸的中性蛋白酶和酶解活性較高、專一性較強的鏈霉菌蛋白酶為雙酶酶解的酶種類。根據(jù)文獻，在兩種酶最適的酶解條件下確定雙酶酶解的先后順序（實驗已得先中性后鏈霉菌較好）。在葉菊芳實驗的基礎(chǔ)上確定鏈霉菌蛋

12、白酶的最適酶解時間、溫度、Ph 、加酶量。通過響應(yīng)面優(yōu)化，確定最佳酶解條件。</p><p><b>　　技術(shù)路線</b></p><p>　　烏賊眼睛玻璃體→鹽溶→酶法提取→滅酶→離心過濾→取上清液→加雙氧水脫色→乙醇沉淀→離心收集沉淀→溴化十六烷基吡啶絡(luò)合→乙醇沉淀→沉淀真空干燥→粗多糖 </p><p>　　四、總體安排與進度：</

13、p><p>　　2009年9月—2010年11月：</p><p>　　1、實驗前的準備工作：查找資料，文獻綜述的撰寫，英文參考文獻的翻譯；</p><p>　　2、文獻整理，實驗方案的確定，完成開題報告</p><p>　　2010年12月—2011年３月：</p><p><b>　　1、開展實驗；</

14、b></p><p>　　2、優(yōu)化實驗方案中的各條件；</p><p>　　3、獲得實驗過程中的各類數(shù)據(jù)。</p><p>　　2011年3月—2011年5月：</p><p>　　1、整理和補充相關(guān)數(shù)據(jù)，整理實驗結(jié)果；</p><p><b>　　2、撰寫論文初稿。</b></p&g

15、t;<p><b>　　3、論文定稿。</b></p><p><b>　　五、主要參考文獻：</b></p><p>　　[1]Evered D，Whelan J，eds。The biology of hyaluronan，ciba foundation symposium 143[M]。John Wiley＆Sons，1989:

16、6-15。</p><p>　　[2] 張紅霞，徐三魁．程寶珠等．提取法制備透明質(zhì)酸的研究[J]．鄭州工業(yè)高等?？茖W校學報，2002，</p><p><b>　　18（3）：6</b></p><p>　　[3] 張彬，周武．羊眼透明質(zhì)酸的制備[J]．食品科技，2004，1</p><p>　　[4] 羅瑞明．透明質(zhì)酸

17、(HA)的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀[J]。．寧夏農(nóng)學院學報，2001，22（1）：62～64</p><p>　　[5] 潘虹梅．透明質(zhì)酸的研究現(xiàn)狀綜述[J]．四川食品與發(fā)酵，2003，1（5）：6～9</p><p>　　[6] 朱廣平，方煜平．透明質(zhì)酸制備方法及應(yīng)用研究的進展[J]．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1996，2（8），382～384</p><p>　　[7] 陳忠杰，

18、郭愛玲。透明質(zhì)酸的應(yīng)用及生產(chǎn)[J]。河南化工，2007，24(7):48-49</p><p>　　[8] 張照明，馮強，高玲玲。透明質(zhì)酸的產(chǎn)需情況及市場分析[J]。精細與專用化妝品，2007，15(9):24-27</p><p>　　[9] 姚美琴．魷魚眼透明質(zhì)酸的提取工藝研究[J]．食品科技，2009，34（5）：241～244</p><p>　　[ 10]

19、 Ricardo P Vieira，Cristiana Pedrosa，Paulo A。S Mourao，et al。Extensive heterogeneity of proteoglycans bearing fucose- branched chondroitin sulfate extraced from the connective tissue of sea cucumber[J]。J Biol。Chem，1993，(

20、32) :2254- 2262。</p><p>　　[ 11] 鄭艾初，陳健等。糙海參酸性粘多糖的提取純化工藝探討[J]?，F(xiàn)代食品科技，2007，23( 5) :65- 67。</p><p>　　[ 12] 羅紅宇，高鵬等。赤魟軟骨粘多糖的制備[J]。中國海洋藥物雜志，2005，24( 4):14-17。</p><p>　　[ 13] 郭玉濤，陳斌，江元汝等。

21、 從牛眼玻璃體中分離純化透明質(zhì)酸的新方法[J]。精細化工，2008，25(3):246-250</p><p>　　[14] 趙玉紅，韓琳琳，遲玉杰．酶法提取雞蛋殼膜中透明質(zhì)酸的研究[J]。食品研究與開發(fā)，2008，29（1）：40～43</p><p>　　[15] 汪建，汪清，謝鎮(zhèn)．酶解條件控制對透明質(zhì)酸工業(yè)化提取的影響[J]。2010，41（1）：20～22</p>&

22、lt;p>　　[16] 劉成梅，萬茵，涂宗財?shù)?。百合多糖脫蛋白方法的研究[J]。食品科學，2002，23(1):89-90</p><p>　　[17] 沈敏，馮睿，劉貝貝等。堿提菜籽多糖脫蛋白方法的研究[J]。食品科技，2006，9:273-275</p><p>　　[18] 汪江波，薛海燕，鄒玉玲，等。調(diào)控細胞通透性以提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和相對分子質(zhì)量[J]。華</p>

23、;<p>　　西藥學雜志，2006，21(5):465-467。</p><p>　　[19] 張可喜。日完成人工合成透明質(zhì)酸[EB /OL]。http: //japan。 people。com。cn /2001/11/25/riben20011125 -14005。html，2005-06 -15</p><p>　　[20] 張照明，馮強，高玲玲。透明質(zhì)酸的產(chǎn)需情況及市場

24、分析[J]。精細與專用化妝品，2007，15(9):24-27</p><p>　　[ 21 ]　張謙朋。不同組織來源透明質(zhì)酸的分離純化及收率比較 [ J ]。聊城大學學報， 2004， 17 (1) : 51 - 53。</p><p>　　[ 22] 洪水聲，陳佳，滕利榮等．獸疫鏈球菌變異株產(chǎn)生的透明質(zhì)酸的純化及表征[J]．高等學校化學學報；2005，5</p>&l

25、t;p>　　[23]周海東，倪晉仁，黃文，等。膜技術(shù)分離透明質(zhì)酸發(fā)酵液可行性研究[J]。食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，</p><p>　　31(11):46-51。</p><p>　　[24 ] 應(yīng)國清，孟優(yōu)娣，游文淑．大孔離子交換樹脂分離純化玻璃酸的研究[J]．離子交換與吸附，1999，15（4）：349～353</p><p>　　[25]Gerard

26、A，Moraima R。 A new chromatographic method for the fractionation of hyaluronic acid[J]。 Biochemical and Biophysical Research Communications，1983，112(1)：168</p><p>　　[26] 郭學平，劉愛華，葛保勝等．過氧化氫氧化降解法制備低分子玻璃酸[J]．1998

27、，68：1～18</p><p>　　[27] Miyazaki T，Yomota C，Okada S．Ultrasonic depolymerization of hyaluronic acid[J]．Polym Degrad Stab，2001，74:77-85。</p><p>　　[28] 賀蕓．透明質(zhì)酸的降解研究[D]。 南京理工大學；2010</p><p&

28、gt;　　[29] 覃彩鳳．低相對分子質(zhì)量透明質(zhì)酸的制備研究[D]。江南大學；2007</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　食品質(zhì)量與安全</b></p><p><b>　　透明質(zhì)酸的研究現(xiàn)狀</b></p><p>　　摘要：

29、透明質(zhì)酸是生物體內(nèi)普遍存在的酸性黏多糖，具有獨特的黏彈性、生物相容性及非免疫原性，在生命科學、食品行業(yè)以及醫(yī)學領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用，本文主要對透明質(zhì)酸的生產(chǎn)、提取、分離純化、降解方法等方面進行綜述。</p><p>　　關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸；提取；純化；HA降解</p><p><b>　　透明質(zhì)酸簡介 </b></p><p>　　透明質(zhì)酸

30、是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元的高分子粘多糖，具有許多天然粘多糖共有的性質(zhì)：呈白色、為無定形固體、無臭無味、具有強烈的吸濕性、溶于水、不溶于有機溶劑等等。由于直鏈軸上單糖之間氫鍵的作用，透明質(zhì)酸分子在空間上呈剛性的螺旋柱型[1]，柱的內(nèi)側(cè)由于存在大量的羥基而產(chǎn)生強烈的親水性；同時羥基的連續(xù)定向排列，又在分子鏈上形成高度的憎水區(qū)，HA分子的親水和憎水特性，使得濃度低于</p><p>　　

31、1‰ 的HA也能形成連續(xù)的三維蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，水分子則在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)通過極性鍵和氫鍵與HA分子相結(jié)合，使得這些水在柱內(nèi)固定不動，不易流失，HA親和吸附的水分約為其本身重量的1000倍，這是其它粘多糖無法比擬的。</p><p>　　且HA具有獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，它在有機體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，具有特殊的保濕作用；分子量大的可在皮膚表面形成膜狀，起到比較強的保濕潤滑作用，而且分子量小的ＨＡ還能被皮膚吸收進入真

32、皮層，促進人體血液循環(huán)、改善中間代謝等，從而使皮膚變得光滑、柔嫩[2]，而且透明質(zhì)酸無致炎性及抗原性，是理想的“粘性手術(shù)”材料，對眼科、骨科手術(shù)的完成和康復起重要作用[3]，所以被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥等方面。但是E. Gura[27]和T. Miyazaki*[28]等人的研究表明，透明質(zhì)酸的構(gòu)想受溫度、pH、外界機械剪應(yīng)力以及鹽濃度的影響，因此在獲得相對分子量分布帶比較窄的的透明質(zhì)酸時需要控制好各個實驗條件。 </p>

33、<p>　　透明質(zhì)酸廣泛分布于各種動物組織中，而且不同的動物組織中得到的與細菌發(fā)酵得到得透明質(zhì)酸無種屬差異[4]。迄今為止，已在很多動物結(jié)締組織以及動物眼玻璃體等組織中已分離得到HA。</p><p>　　目前所了解的制備透明質(zhì)酸的方法主要有兩種，一種是從動物組織中提取，一種是從微生物發(fā)酵液中提取[5]。國內(nèi)大多從雞冠以及動物眼球等組織中提取透明質(zhì)酸。但是動物組織提取法所得的HA的純度相對不是很高，而

34、且生產(chǎn)效率低、成本高，其原料來源也受限制。雖然該法有很多缺陷，但它仍然是現(xiàn)今生產(chǎn)醫(yī)學用HA主要的方法[6]。</p><p><b>　　透明質(zhì)酸研究現(xiàn)狀</b></p><p>　　2.1　透明質(zhì)酸的提取</p><p>　　HA制備的方法目前主要有組織提取法、細菌發(fā)酵法和人工合成法。</p><p>　　組織提取法工

35、藝流程比較簡單，獲得的HA分子量也較大，一般都大于60萬，且其粘度高，保濕性能好。透明質(zhì)酸在動物組織中的分布很廣泛，幾乎所有的動物組織中均含有一定水平的透明質(zhì)酸，只是含量不同而已。目前我們已從下列組織中分離出了透明質(zhì)酸：結(jié)締組織、臍帶、皮膚、人血清、雞冠、關(guān)節(jié)滑液、腦、軟骨、眼玻璃體、人尿、雞胚、兔卵細胞、動脈和靜脈等，但考慮到原料透明質(zhì)酸含量的高低、數(shù)量的多少和提取難易的程度等因素的影響，能夠真正投與生產(chǎn)的原料主要為雞冠、人臍帶和動物

36、眼球，同時HA又還與硫酸軟骨素等粘多糖共存于生物組織中，這就導致透明質(zhì)酸提純難度加大，生產(chǎn)成本較高[7～8]。</p><p>　　姚美琴等[9]采用水提醇沉，等電點法脫蛋白質(zhì)與超濾相結(jié)合的加工工藝，運用正交實驗法對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，制備得到的透明質(zhì)酸為白色粉末，得率為 2.96% 。 </p><p>　　酶法提取一般有單酶提取和雙酶提取兩種，但由于蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵

37、，因此為去除生成物中較長的肽段在不改變糖鏈結(jié)構(gòu)的前提下，可先采用堿提法或Gdn-HCl抽提法[10—12], 再用兩種或兩種以上的酶水解, 能有效地提高粘多糖的得率。所得的多糖提取液有的因粘稠，常常用離心法除去不溶物。郭育濤[13]，趙玉紅[14]等人用胰蛋白酶水解動物組織，得到純度較好的HA；汪建等[15]人采用粗胰蛋白酶水解雞冠，并分批次加入酶，水解效果較好。此外常見的水解酶還有木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶、和鏈霉菌蛋白酶等。</p

38、><p>　　酶法脫蛋白效果較好，損失率低，但酶解強度不宜過大、時間不宜過長，否則易使太多多糖-蛋白質(zhì)的復合物分解，造成某些多糖-蛋白質(zhì)復合物特有的生理活性降低[16,17]。</p><p>　　細菌發(fā)酵法是利用某些種屬的鏈球菌，如獸疫鏈球菌，在生長繁殖過程中，向胞外分泌以透明質(zhì)酸為主要成分的莢膜。細菌發(fā)酵法與動物組織提法相比，具有生產(chǎn)規(guī)模不受動物原料限制，發(fā)酵液中透明質(zhì)酸以游離狀態(tài)存在,易

39、于分離純化，成本低，易于形成規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，無動物來源的致病病毒污染的危險等優(yōu)點，但產(chǎn)率較低，一般不會超過0.2%，得到的透明質(zhì)酸分子量也較低。 汪江波[18]等人首次通過亞硝基胍(NTG)誘變獲得甘油缺陷型菌株，通過控制甘油的添加量來調(diào)節(jié)細胞膜的通透性，透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和相對分子質(zhì)量都可達到較高水平。據(jù)文獻查詢，目前國際透明質(zhì)酸發(fā)酵水平最高為6.5g/L。</p><p>　　透明質(zhì)酸無種屬差異，不同動物組織提取

40、的及不同菌種發(fā)酵生產(chǎn)的透明質(zhì)酸，在化學本質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)上是一致的，只是相對分子質(zhì)量（Ｍr）有差別。</p><p>　　日本京都大學[19]通過天然酶聚合反應(yīng)，人工合成出了用途廣泛的 HA。使用多糖類聚合物合成“透明質(zhì)酸氧氨雜環(huán)戊烯衍生物”，然后添加水解酶產(chǎn)出衍生物和酶的復合體，再清除反應(yīng)液中的酶合成 HA。據(jù)報道，人工合成的 HA與天然品在質(zhì)量上沒有差別。諾維信與美國的 Hyalose LLC公司在進行利用帶有

41、HA遺傳信息的基因植入微生物體內(nèi)，進行HA 生產(chǎn)的研究。以上兩種方法處于研究階段,若能實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn) HA，為人類社會提供質(zhì)優(yōu)價廉的產(chǎn)品,將是 HA行業(yè)的一場革命[20]。</p><p>　　2.3 透明質(zhì)酸純化</p><p>　　通過查找文獻可知，分離純化透明質(zhì)酸的方法有：酶分解結(jié)合季銨鹽法、季銨鹽法、酶分解與樹脂交換法、離子交換層析法 、芳香樹脂和活性炭法、電—膜分離法、超濾法、季

42、銨鹽-DEAE -凝膠過濾法等。不過從動物組織中分離純化透明質(zhì)酸，純化中使用季銨鹽的話不但操作過程復雜，而且透明質(zhì)酸損失比較大；芳香樹脂和活性炭法的 HA損失也比較大；電-膜分離方法純化程度有限；離子交換法操作不穩(wěn)定，不容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)操作。 </p><p>　　張謙朋等[21]采取了DEAE一纖維素柱層析法和蛋白水解酶降解法處理樣品，分別對雞冠和臍帶GAG中的蛋白部分處理，再利用各種GAG和季銨鹽(如氯代十

43、六烷基吡啶）生成的復合物在氯化鈉溶液中解離所需的臨界鹽濃度不同而將所得的GAG復合物分級分離。已知透明質(zhì)酸氯代十六烷基吡啶復合物解離所需鹽濃度遠較其他含硫酸基的GAG為低，因此選擇適當?shù)牡望}濃度，在其他GAG復合物保持不溶性的同時，透明質(zhì)酸季銨鹽優(yōu)先解離而成游離的可溶性聚糖，從而獲得多糖純品。</p><p>　　洪水聲等[22]用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)對獸疫鏈球菌進行誘變，獲得高產(chǎn)菌株。經(jīng)

44、過對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，將產(chǎn)生的多糖經(jīng)Savage法、季銨復合物沉淀法、DEAE-纖維素(DE52)離子交換層析法及SephadexG-75凝膠過濾法分離純化，純化的多糖結(jié)構(gòu)經(jīng)化學組成分析、核磁共振波譜、紅外光譜及圓二色譜鑒定，證明了誘變得到的高產(chǎn)菌株(Streptococcus zooepidemicusJ18)再經(jīng)發(fā)酵，得到的多糖為透明質(zhì)酸，通過剛果紅實驗證明了透明質(zhì)酸的構(gòu)象為單股螺旋結(jié)構(gòu),其平均分子量約為1.16×106

45、。</p><p>　　周海東等人[23]研究了利用膜技術(shù)分離透明質(zhì)酸發(fā)酵液的可行性，試驗表明，采用微濾和超濾相結(jié)合的工藝能夠?qū)崿F(xiàn)HA發(fā)酵液的分離提純。</p><p>　　應(yīng)國清等[24 ]采用D315大孔離子交換樹脂進行分離純化透明質(zhì)酸，以去離子水為淋洗液, 0.6mol/L NaCl溶液為洗脫液 ,純化效果較佳?！?lt;/p><p>　　Gerard等[25]曾

46、報道了采用DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖分離HA的研究，但由于這兩種層析劑價格昂貴，限制了在工業(yè)上的應(yīng)用。</p><p>　　2.4 透明質(zhì)酸降解</p><p>　　HA聚合鏈很容易在各種理化因素如機械（剪切）應(yīng)力、熱降解、輻射作用、氧化和酶消化等條件下被降解。目前，主要有化學法、物理法和酶法三類降解方法</p><p>　　2.4.1 化學降解法</

47、p><p>　　研究表明化學降解主要由水解和羥基上的活性氧引起的。Tokita等對HA在不同pH條件下的水解降解進行了研究，并對機理進行了探討。結(jié)果表明，在酸性條件下，水解發(fā)生在糖醛酸殘基上的C1、C4和羰基C所連的C等部位，在C1和C4部位的水解導致鏈的斷裂，保留半縮醛環(huán)。在堿性溶液中，斷裂則多發(fā)生在C1、環(huán)中的O及乙酰氨基上的N原子上。</p><p>　　郭學平等[26]人研究表明隨著過

48、氧化氫濃度增加，反應(yīng)溫度的升高，降解速率加快。中性條件下 HA的氧化降解速率較快，而酸性或堿性時卻較慢。為了方便降解過程的可控性，過氧化氫濃度選0. 05 % ，反應(yīng)溫度定為50℃，反應(yīng)pH為中性。隨著 HA相對分子質(zhì)量的降低，運動黏度迅速下降，而糖醛酸含量基本不變。不同過氧化氫濃度降解時，低分子HA收率基本相同。E. Gura [27]研究發(fā)現(xiàn) 高分子量的透明質(zhì)酸在超聲波處理后被降解為分子量在0.4～2.0×106 g/mo

49、l之間的HA分子。且發(fā)現(xiàn)當pH小于1.5或者pH大于11時，HA分子被不可逆的水解破環(huán)。</p><p>　　2.4.2 物理降解法</p><p>　　常見的物理降解方法主要是超聲波法，Miyazaki等[28]研究了超聲降解HA過程中聲強、溫度、HA濃度、共存離子、離子強度對降解的影響。研究發(fā)現(xiàn),溫度越低越有利于降解Mr的降低，推斷原因為溫度高時，HA黏度下降,分子間運動加劇,機械剪切

50、力一部分轉(zhuǎn)化為振動能；溫度高時，蒸汽壓增大，空化氣泡中的氣體增加,由于緩沖作用，空化氣泡塌陷的機會減少；而且，溫度升高導致溶解在溶液中的氣體減少。聲強是最主要的影響因素。</p><p>　　有專利報道，聯(lián)合使用超聲波和次氯酸鈉降解HA的方法可降解制得Mr在5×103一 2×104的低分子量HA，分子量分布較窄。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)，在中性、堿性條件下超聲降解變化不大，過氧化氫存在的超聲降

51、解，降解后HA有結(jié)構(gòu)變化。</p><p>　　賀蕓等[29]研究了電化學法和高壓均質(zhì)法降解透明質(zhì)酸。采用電化學法降解透明質(zhì)酸時，采用Ti/Sb一SnOZ電極進行電解實驗，其降解效果隨著降解時間的增加而提高，隨著電流密度的增加而提高，隨著初始濃度的增加而降低，隨著電解質(zhì)濃度的增加而降低，隨電解溫度的增加而提高。采用高壓均質(zhì)法降解透明質(zhì)酸時發(fā)現(xiàn)其降解效果隨著初始相對分子量的增加而提高，隨著初始濃度的增加而降低，隨著

52、均質(zhì)壓力的增加而提高，隨著循環(huán)次數(shù)的增加而提高，不隨氯化鈉濃度和均質(zhì)溫度的變化而變化。</p><p>　　此外，物理方法有機械剪切力法、微波法、Y射線輻射法、加熱法和紫外線照射法等。經(jīng)過物理降解后HA紅外光譜與降解前比較無差異，因為降解力作用于HA分子鏈，致使分子鏈斷裂。</p><p>　　2.4.3 酶法降解[30]</p><p>　　生物大分子的酶法水解由

53、于其專一性強、反應(yīng)條件溫和并且沒有副產(chǎn)物，常被人們</p><p>　　首選用于大分子的降解。透明質(zhì)酸酶是對催化降解透明質(zhì)酸的酶的通稱。酶解法是降解HA溫和的方法，最適于制備oligo-HA。酶解主要是透明質(zhì)酸酶和硫酸軟骨素酶兩種。因為化學降解等方法將HA降解成寡聚糖，需要較劇烈的反應(yīng)條件，如較高的酸、堿濃度等，才能達到高的降解程度。此時不但糖鏈上的糖苷鍵斷裂，而且單糖(葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖)殘基的結(jié)構(gòu)也可能遭

54、到破壞，如乙酰基被水解掉、單糖六元環(huán)斷裂等。當然酶解法也可用于制備LMW-HA。Mahoney將HA用玻璃酸酶降解，然后經(jīng)凝膠色譜和陰離子交換色譜純化分別制得4~34糖，其中4~16糖在糖鏈長度上是均一的，即純化得到均一的4、6、8、…16糖；18～34糖是這些糖的混合物。制備均一的oligo-HA很重要，分別對幾種均一oligo-HA的生物活性進行研究，可以明確某種寡糖的作用，而不是多種寡糖混合物的作用。</p><

55、;p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] Evered D,Whelan J,eds.The biology of hyaluronan,ciba foundation symposium 143[M].John Wiley＆Sons,1989:6-15.</p><p>　　[2] 張紅霞，徐三魁．程寶珠等．提取法制備透明質(zhì)酸的研究[J]

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68、29] 賀蕓．透明質(zhì)酸的降解研究[D]. 南京理工大學；2010．</p><p>　　[30] 覃彩鳳．低相對分子質(zhì)量透明質(zhì)酸的制備研究[D]．江南大學；2007．</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　雙酶法對

69、烏賊眼中透明質(zhì)酸提取率的影響</p><p><b>　　目　錄 </b></p><p><b>　　1引言1 </b></p><p>　　1.1透明質(zhì)酸性質(zhì)1 </p><p>　　1.2透明質(zhì)酸提取現(xiàn)狀1</p><p>　　1.3本文的主要研究內(nèi)容及

70、意義2</p><p><b>　　2材料與方法2</b></p><p>　　2.1材料與設(shè)備2</p><p>　　2.1.1材料2</p><p>　　2.1.2設(shè)備2</p><p><b>　　2.2方法2</b></p><

71、;p>　　2.2.1酶活力測定2</p><p>　　2.2.2葡萄糖醛酸標準曲線制作4</p><p>　　2.2.3透明質(zhì)酸粗品的制備工藝5</p><p>　　2.2.4 透明質(zhì)酸的純化工藝5</p><p>　　2.2.5 透明質(zhì)酸含量測定 5</p><p>　　2.2.6透明質(zhì)酸

72、紫外光譜5</p><p>　　3 結(jié)果與討論5</p><p>　　3.1中性蛋白酶的工藝條件5</p><p>　　3.2鏈霉菌蛋白酶酶解條件優(yōu)化5</p><p>　　3.2.1酶解時間6</p><p>　　3.2.2酶解溫度6</p><p>　　3.2.3 酶解

73、PH 7</p><p>　　3.2.4 酶濃度8 </p><p>　　3.3酶法提取透明質(zhì)酸的正交試驗8</p><p>　　3.4 透明質(zhì)酸紫外光譜9</p><p><b>　　4小結(jié)11</b></p><p><b>　　致謝12</b></

74、p><p><b>　　參考文獻13</b></p><p><b>　　1</b></p><p>　　摘 要：透明質(zhì)酸是生物體內(nèi)普遍存在的酸性黏多糖，具有獨特的黏彈性、生物相容性及非免疫原性，在生命科學、食行業(yè)以及醫(yī)學領(lǐng)域都有較為廣泛的應(yīng)用。本文對烏賊眼液進行雙酶提取，首先使用4%中性蛋白酶在60°C下進行4h

75、的酶解，然后用鏈霉菌蛋白酶進行二次酶解，再通過CTAB絡(luò)合，乙醇沉淀得到最終透明質(zhì)酸。 最后通過正交實驗，優(yōu)化了鏈霉菌蛋白酶提取透明質(zhì)酸的最佳工藝條件，實驗結(jié)果表明，在酶用量6%，pH為7,酶解時間4h，酶解溫度為55℃時，此時透明質(zhì)酸的紫外吸光度為1.1970，得到的透明質(zhì)酸提取率為12.46% ，通過紫外-可見光譜對比可看出提取得到的透明質(zhì)酸純度較好。</p><p>　　關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸；提??；鏈霉菌蛋白酶

76、；烏賊</p><p>　　Abstract：Hyaluronic acid is organisms widespread acidic sticky polysaccharide, has a unique viscoelastic, biocompatible and non-immunogenic, in life sciences, food industry and medical domain ha

77、s a wide range of applications. In this paper, the two enzymes extracted squid eye drops, first to conduct a neutral protease enzyme(enzyme concentration was 4% ,temperature of 60 °C, enzyme extraction time was 4h)

78、using crude extract obtained by HA intermediate goods, then a second protease enzyme Strept</p><p>　　Keywords: Hyaluronic acid; extraction; Streptomyces protease; squid </p><p><b>　　引言<

79、/b></p><p>　　1.1 透明質(zhì)酸性質(zhì)</p><p>　　透明質(zhì)酸是一種由D-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸為結(jié)構(gòu)單元的高分子粘多糖，由于直鏈軸上單糖之間氫鍵的作用，透明質(zhì)酸分子在空間上呈剛性的螺旋柱型[1]，柱的內(nèi)側(cè)由于存在大量的羥基而產(chǎn)生強烈的親水性；同時羥基的連續(xù)定向排列，又在分子鏈上形成高度的憎水區(qū)，HA分子的親水和憎水特性，使得濃度低于1‰的HA也能形成連

80、續(xù)的三維蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，水分子則在網(wǎng)絡(luò)內(nèi)通過極性鍵和氫鍵與HA分子相結(jié)合，使得這些水在柱內(nèi)固定不動，不易流失，HA親和吸附的水分約為其本身重量的1000倍，這是其它粘多糖無法比擬的。</p><p>　　HA具有獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，它在有機體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能，具有特殊的保濕作用；分子量大的可在皮膚表面形成膜狀，起到比較強的保濕潤滑作用，而且分子量小的ＨＡ還能被皮膚吸收進入真皮層，促進人體血液循環(huán)、

81、改善中間代謝等，從而使皮膚變得光滑、柔嫩[2]，而且透明質(zhì)酸無致炎性及抗原性，是理想的“粘性手術(shù)”材料，對眼科、骨科手術(shù)的完成和康復起重要作用[3]，所以被廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥等方面。但是E. Gura[4]和T. Miyazaki*[5]等人的研究表明，透明質(zhì)酸的構(gòu)想受溫度、pH、外界機械剪應(yīng)力以及鹽濃度的影響，因此在獲得相對分子量分布帶比較窄的的透明質(zhì)酸時需要控制好各個實驗條件。 </p><p>　　1.

82、2 透明質(zhì)酸提取現(xiàn)狀</p><p>　　透明質(zhì)酸廣泛分布于各種動物組織中，而且不同的動物組織中得到的與細菌發(fā)酵得到得透明質(zhì)酸無種屬差異[6]。目前所了解的制備透明質(zhì)酸的方法主要有兩種，一種是從動物組織中提取，一種是從微生物發(fā)酵液中提取[7]。國內(nèi)大多從雞冠以及動物眼球等組織中提取透明質(zhì)酸。但是動物組織提取法所得的HA的純度相對不是很高，而且生產(chǎn)效率低、成本高，其原料來源也受限制。雖然該法有很多缺陷，但它仍然是現(xiàn)

83、今生產(chǎn)醫(yī)學用HA主要的方法[8]。</p><p>　　HA制備的方法目前主要有組織提取法、細菌發(fā)酵法和人工合成法。</p><p>　　組織提取法的工藝流程比較簡單，獲得的HA分子量也較大，一般大于60萬，且其粘度高，保濕性能好。透明質(zhì)酸在動物組織中的分布很廣泛，幾乎所有的動物組織中都含有一定水平透明質(zhì)酸，只是含量不同而已。目前我們已從下列組織中分離出了透明質(zhì)酸：結(jié)締組織、臍帶、皮膚、人

84、血清、雞冠、關(guān)節(jié)滑液、腦、軟骨、眼玻璃體、人尿、雞胚、兔卵細胞、動脈和靜脈等，但考慮到原料中透明質(zhì)酸含量的高低、數(shù)量的多少和提取難易的程度等因素的影響，能夠真正投于生產(chǎn)的原料主要為雞冠、人臍帶和動物眼球，同時HA又還與硫酸軟骨素等粘多糖共存于生物組織中，這就導致了透明質(zhì)酸提純難度加大，生產(chǎn)成本也比較高[9-10]。</p><p>　　姚美琴等[11]采用水提醇沉，等電點法脫蛋白質(zhì)與超濾相結(jié)合的加工工藝，運用正交

85、實驗法對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，制備得到的透明質(zhì)酸為白色粉末，得率為 2.96% 。 </p><p>　　酶法提取一般有單酶提取和雙酶提取兩種，但由于蛋白酶不能斷裂糖肽鍵及其附近的肽鍵，因此為去除生成物中較長的肽段在不改變糖鏈結(jié)構(gòu)的前提下，可先采用堿提法或Gdn-HCl抽提法[12—14], 再用兩種或兩種以上的酶水解, 能有效地提高粘多糖的得率。所得的多糖提取液有的因粘稠，常常用離心法除去不溶物。郭育濤[15]

86、，趙玉紅[16]等人用胰蛋白酶水解動物組織，得到純度較好的HA；汪建等[17]人采用粗胰蛋白酶水解雞冠，并分批次加入酶，水解效果較好。此外常見的水解酶還有木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶、和鏈霉菌蛋白酶等。</p><p>　　酶法脫蛋白效果較好，損失率低，但酶解強度不宜過大、時間不宜過長，否則易使太多多糖-蛋白質(zhì)的復合物分解，造成某些多糖-蛋白質(zhì)復合物特有的生理活性降低[18,19]</p><p&g

87、t;　　透明質(zhì)酸無種屬差異，不同動物組織提取的透明質(zhì)酸，在化學本質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)上是一致的，只是相對分子質(zhì)量（Ｍr）有差別。</p><p>　　本文的主要研究內(nèi)容及意義</p><p>　　以烏賊眼球為原料提取透明質(zhì)酸方面的研究在國內(nèi)未見報道，而烏賊眼睛是一類數(shù)量巨大的廢棄物，相對于其他魚眼較大，晶狀體所占體積也大。在水產(chǎn)品加工過程中產(chǎn)生大約15%-40%的下腳料，其中魚眼約占2-5%，所以

88、如何從廢棄的烏賊眼球中提取透明質(zhì)酸，進行科學的綜合利用，變廢為寶是一件非常有意義的事。本研究以烏賊魚眼為原料， 研究了烏賊眼透明質(zhì)酸的提取工藝，使烏賊資源得以合理開發(fā)利用，從而利于提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟附加值，變廢為寶。</p><p>　　本實驗確定了最佳提取工藝：以透明質(zhì)酸得率為指標，通過單因素和正交試驗考察了酶解時間、pH值、酶解溫度、酶用量對HA提取率的影響，并優(yōu)化了工藝參數(shù)。</p>

89、<p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　　2.1 材料和設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1 材料</b></p><p>　　烏賊：來自寧波莊市菜市場，清洗破碎，收集眼睛中的液體，除去泥沙、色素等沉淀后備用。 </p><p>　　中性蛋白酶（20萬u

90、/g，南寧龐博生物工程有限公司），鏈霉菌蛋白酶（4000　u/g，北京奇松生物有限公司進口分裝），葡萄糖醛酸，其余試劑均為分析純</p><p><b>　　2.1.2 設(shè)備</b></p><p>　　電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；冷凍高速離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；T6-新銳可

91、見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Cary100紫外分光光度計，美國Varian公司。</p><p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 酶活力測定 [20]</p><p>　　2.2.1.1 試劑</p><p>　　福林試劑(Folin試劑)：于2000 mL磨口回流

92、裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100 g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25 g，蒸餾水700 mL，85%磷酸50 mL，濃鹽酸100 mL，文火回流10 h。取去冷凝器，加入硫酸鋰(Li2SO4)50 g，蒸餾水50 mL，混勻，加入幾滴液體溴，再煮沸15 min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴溴液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000 mL，用細菌漏斗

93、過濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。</p><p>　　0.4 mol碳酸鈉溶液：稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4 g，定容至1000 mL。</p><p>　　0.4 mol三氯乙酸(T C A)溶液：稱取三氯乙酸(CCl3COOH) 65.4 g，定容至1000 mL。pH 7.2磷酸鹽緩沖液： 稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·

94、;2H2O) 31.2 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol溶液(A液)。稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 71.63 g，定容至1000 mL，即成0.2 mol溶液(B液)。取A液28 mL和B液72 mL，再用蒸餾水稀釋1倍，即成0.1 mol pH 7.2的磷酸鹽緩沖液。</p><p>　　2% 酪蛋白溶液:準確稱取干酪素2 g，稱準至0.002 g，加入0.1 mol/L

95、氫氧化鈉10 mL，在水浴中加熱使溶解(必要時用小火加熱煮沸)，然后用pH 7.2磷酸鹽緩沖液定容至100 mL即成。配制后應(yīng)及時使用或放入冰箱內(nèi)保存。</p><p>　　100 μg/mL酪氨酸溶液:精確稱取在105 ℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000 g，逐步加入6 mL 1 mol/L鹽酸使溶解，用0.2 mol/L鹽酸定容至100 mL，其濃度為1000 μg/mL，再吸取此液10 mL，以0.2 m

96、ol/L鹽酸定容至100 mL，即配成100 μg/mL的酪氨酸溶液。</p><p>　　2.2.1.2 標準曲線的繪制</p><p>　　分別吸取不同濃度酪氨酸1 mL，各加入0.4 mol碳酸鈉5 mL，再各加入已稀釋的福林試劑1 mL。搖勻置于水浴鍋中。40 ℃保溫發(fā)色20 min在660 nm波長測OD值。一般測三次，取平均值，同時做空白試驗。</p><

97、p>　　所得酶活力標準曲線回歸方程為：y=0.0115x+0.0145，相關(guān)系數(shù) R=0.9987，其中，Y：吸光度；X：酪氨酸濃度(ug/mL)，繪制標準曲線見圖1。</p><p>　　圖1 酪氨酸標準曲線 </p><p>　　Fig.1 Standard curve of enzyme activity</p><p>　　2.2.

98、1.3 樣品測定</p><p>　　稱取酶粉0.100 g，加入pH 7.2磷酸鹽緩沖液定容至100 mL，吸取此液5 mL，再用緩沖液稀釋至25 mL，即成5000倍的酶粉稀釋液。取樣品稀釋液1 mL，置于40 ℃水浴中預(yù)熱2 min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1 mL，精確保溫10 min，時間到后，立即再各加入0.4 mol三氯乙酸2 mL，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫20 min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后

99、離心或過濾，然后另取濾液1 mL，再加0.4 mol碳酸鈉5 mL，已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻，40 ℃保溫發(fā)色20 min后進行光密度(OD)測定。空白試驗測定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白。計算方法為在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位。</p><p>　　樣品蛋白酶活力單位(干基) = ×4×

100、N×</p><p><b>　　式中：</b></p><p>　　A —由樣品測得OD值，查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(或OD值×K)；</p><p>　　4 —4 mL反應(yīng)液取出1 mL測定(即4倍)；</p><p>　　N —酶液稀釋的倍數(shù)；</p><p>　　

101、10 —反應(yīng)10 min；</p><p>　　W —樣品水分百分含量。</p><p>　　2.2.2 葡萄糖醛酸標準曲線制作</p><p>　　2.2.2.1 標準曲線的制作</p><p>　　精密稱取葡糖醛酸(AR)20mg，置100ml量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻備用。精密量取標準溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，

102、分別加入10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，得10、20、30、40和50μg/ml濃度的對照品溶液。取6只具塞刻度試管分別加入硼砂硫酸液5ml，置冰浴中冷至4℃左右。然后分別取空白溶液(蒸餾水)和不同濃度的對照品溶液各1ml加入試管中，先輕輕振搖，再充分混勻，并不斷用冰浴冷卻，將試管置沸水中加熱10min，置常水中冷至室溫。加入咔唑試劑0.2ml，混勻，水浴中再加熱15min，冷至室溫。在530nm處測定吸收度Ａ，以吸收度對濃度Ｃ作圖即可

103、繪出標準曲線,或作直線回歸數(shù)據(jù)處理,計算出吸收度和濃度的線性回歸方程:C=b+kA，b－截距，k－斜率。</p><p>　　所得標準曲線回歸方程為：y=0.0130x+0.0136，相關(guān)系數(shù) R=0.9963，其中，Y：吸光度；X：葡萄糖醛酸濃度(ug/mL)，繪制標準曲線見圖2。</p><p>　　圖2 葡萄糖醛酸標準曲線</p><p>　　Fig.2 St

104、andard curve of glucuronic acid</p><p>　　樣品的測定：取待測樣品溶液 1mL，按照繪制標準曲線的方法測定吸光度。從標準曲線上查出</p><p>　　相應(yīng)的葡糖醛酸濃度。按照下式計算得透明質(zhì)酸得率（以干重計）： </p><p>　　透明質(zhì)酸提取率（%）＝ （1）</p><p>　　2.2.2

105、.2 樣品測定</p><p>　　取本品0.1g/L的溶液1ml，照標準曲線項下的方法測定吸收度。從標準曲線上查出相應(yīng)的葡糖醛酸濃度，按（1）式計算含量。</p><p>　　2.2.3 透明質(zhì)酸中間品的制備工藝 </p><p>　　烏賊眼液 →鹽提→中性蛋白酶一次酶解→雙氧水脫色→乙醇沉淀→沉淀真空冷凍干燥→透明質(zhì)酸中間品 </p><p

106、>　　2.2.4 透明質(zhì)酸的純化工藝</p><p>　　透明質(zhì)酸中間品→溶解 →鏈霉菌蛋白酶二次酶解→CTAB絡(luò)合→乙醇沉淀→沉淀真空冷凍干燥→透明質(zhì)酸多糖粗品 </p><p>　　2.2.4.1 鏈霉菌蛋白酶二次酶解</p><p>　　將透明質(zhì)酸中間品配置成5×10-3g/ml濃度的溶液，酶解時吸取10ml樣液置于錐形瓶中，與鏈霉菌蛋白酶

107、在選擇的條件下充分反應(yīng)，然后沸水浴酶滅活10min，離心取上清液。 </p><p>　　2.2.4.2 CTAB絡(luò)合</p><p>　　在所得的上清液中,加入等體積的質(zhì)量體積分數(shù)為1%的CTAB溶液,形成絮狀絡(luò)合物.靜置過夜,使絡(luò)合完全.以6000 r/min離心10 min,將沉淀溶于1.5 mol/L的NaCl溶液中,以相同條件離心除去不溶物.取上清液加3.5倍體積的95%濃度的

108、乙醇使多糖沉淀。</p><p>　　2.2.5 透明質(zhì)酸含量測定</p><p>　　葡萄糖醛酸含量采用Bitter-Muir咔唑法測定，經(jīng)換算得到樣品中HA的含量。</p><p>　　2.2.6 透明質(zhì)酸紫外光譜</p><p>　　將上述純化得到的樣品溶解于水中，利用紫外分光光度計在紫外波長下掃描。</p><p&

109、gt;<b>　　3 結(jié)果和討論</b></p><p>　　3.1 中性蛋白酶的工藝條件</p><p>　　本實驗在中性蛋白酶與鏈霉菌蛋白酶雙酶解技術(shù)，首先將烏賊眼液先用0.2mol/L的NaCl溶液鹽提4h，加入4%的中性蛋白酶，在60°C下酶解4h，沸水浴中滅酶10min后，離心取上清液。加雙氧水脫色后用乙醇沉淀，然后將沉淀進行冷凍干燥得到透明質(zhì)