落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)基因LaSERK1的表達(dá)模式及其抗體制備研究.pdf

1、落葉松（Larix spp.）是重要的速生造林樹種，目前其體細(xì)胞胚胎發(fā)生作為一種新的繁殖技術(shù)已取得突破性進(jìn)展。然而，胚性細(xì)胞誘導(dǎo)困難、畸形胚的出現(xiàn)和同步化困難等還是胚性細(xì)胞誘導(dǎo)過程中尚待解決的瓶頸問題，而分子機(jī)制的研究可能給體細(xì)胞胚胎發(fā)育帶來新的變革。目前體細(xì)胞胚胎發(fā)育相關(guān)基因基因已經(jīng)克隆到多個(gè)，但是大多數(shù)都是在體細(xì)胞胚胎發(fā)育后期起作用，SERK1是目前為止唯一發(fā)現(xiàn)在體細(xì)胞胚胎發(fā)育前期起作用的基因。SERK1基因是體胚發(fā)生早期的重要基因

2、，因此研究落葉松SERK1基因在落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程早期由愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞的過程中所起的作用對于落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究具有重要意義。本研究從體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)受體類蛋白激酶SERK1入手，克隆了日本落葉松（Larix leptolepis）體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)受體類蛋白激酶基因LaSERK1，對其進(jìn)行了表達(dá)模式分析和原核表達(dá)并進(jìn)行了抗體制備。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)克隆了落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)受體類蛋白激酶

3、LaSERK1基因，并將其翻譯為蛋白后與其他物種SERK1進(jìn)行了一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)比對，比對后發(fā)現(xiàn)它們有高度相似性;
　　 (2) qRT-PCR結(jié)果顯示胚性細(xì)胞在含有脫落酸(Abscisic acid，ABA)激素的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，LaSERK1在體胚發(fā)生早期高表達(dá)，但是在第七天時(shí)明顯降低，之后的各階段基本呈遞減趨勢。這些結(jié)果表明LaSERK1可能在落葉松體胚發(fā)育早期起重要作用;
　　 (3)當(dāng)胚性細(xì)胞在無激素簡單

4、繼代培養(yǎng)基中生長時(shí)，LaSERK1基因的表達(dá)比在含有2，4-D和BA的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞低很多，說明激素2，4-D和BA對LaSERK1基因的表達(dá)有一定的誘導(dǎo)作用;
　　 (4)構(gòu)建了pSuper1300-GFP-LaSERK1亞細(xì)胞定位載體，證明LaSERK1定位在細(xì)胞膜上的，這也與其作為受體的功能相對應(yīng);
　　 (5)構(gòu)建了LaSERK1蛋白胞外段原核表達(dá)載體pET28a(+)-His-ecLaSERK1，在體外

5、對LaSERK1蛋白胞外段結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了原核表達(dá)，并以此肽段為抗原制備了相關(guān)抗體，使用ELISA技術(shù)對其抗體進(jìn)行了效價(jià)檢測，得到較好的結(jié)果（效價(jià)1∶2500），日后可以將此抗體用于對體細(xì)胞胚胎發(fā)育過程中各階段LaSERK1蛋白表達(dá)量的Western blot檢測以及用于免疫組化實(shí)驗(yàn)以研究體細(xì)胞胚胎發(fā)育過程中各階段LaSERK1蛋白在胚團(tuán)和成熟胚中的表達(dá)位置。
　　 綜上所述，LaSERK1可能在落葉松體胚發(fā)育早期起重要作用，且在體