落葉松體細(xì)胞胚全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生是林木無(wú)性系及新品種規(guī)?；敝车闹饕侄?，也是研究植物細(xì)胞全能性的理想模式體系，在林木的品種改良、規(guī)?；敝?、種質(zhì)保存及遺傳轉(zhuǎn)化等諸多領(lǐng)域均有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。然而，落葉松胚性組織因長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)存在胚性組織轉(zhuǎn)變?yōu)榉桥咝越M織的現(xiàn)象，且存在原胚發(fā)育質(zhì)量不高、發(fā)生數(shù)量低、難以同步化等問(wèn)題。因此，從分子水平研究體細(xì)胞胚發(fā)生發(fā)育表達(dá)調(diào)控機(jī)制，揭示體細(xì)胞胚發(fā)生發(fā)育機(jī)理，可為建立高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚發(fā)生體系奠定基礎(chǔ)。本研究：（1）以

2、日本落葉松胚性細(xì)胞系638為實(shí)驗(yàn)材料，利用SMART技術(shù)構(gòu)建了落葉松體細(xì)胞胚全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)；（2）通過(guò)454 GS FLX Titanium高通量測(cè)序平臺(tái)，獲得了日本落葉松體細(xì)胞胚原胚團(tuán)時(shí)期轉(zhuǎn)錄組信息，對(duì)所得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析及注釋。主要結(jié)果如下：
　　1.文庫(kù)構(gòu)建與分析研究表明，所建初始文庫(kù)滴度為2.25×106pfu/mL，重組率為95.13％，擴(kuò)增文庫(kù)滴度為2.65×109pfu/mL，插入片段長(zhǎng)度主要分布

3、在0.5～2kb之間，平均長(zhǎng)度為850bp；說(shuō)明所構(gòu)建文庫(kù)質(zhì)量高、代表性好，能用于目的基因分離篩選及表達(dá)。
　　2.從初始文庫(kù)中隨機(jī)挑選16個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，成功測(cè)序15個(gè)，經(jīng)去除低質(zhì)量序列，拼接獲得13個(gè)unigenes，包括2個(gè)contigs和11個(gè)singletons，其中3個(gè)unigenes有已知功能，2個(gè)unigenes具推測(cè)功能，2個(gè)unigenes功能未知，6個(gè)unigenes在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)同源序列，結(jié)果表明，能從

4、構(gòu)建的文庫(kù)中分離得到低豐度表達(dá)基因或者落葉松體細(xì)胞胚特有的新基因。
　　3.對(duì)原胚團(tuán)時(shí)期落葉松胚性細(xì)胞系638進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究顯示：
　?。?）1/2的454測(cè)序共獲得591759條原始reads，經(jīng)重頭拼接后獲得32321個(gè)contigs和38606條singletons，即70927條ESTs，去掉小于100bp的EST序列，余65115條高質(zhì)量ESTs。表明，454高通量測(cè)序技術(shù)是目前大規(guī)模獲得ESTs序列的有效方式。<

5、br>　?。?）綜合Uniprot及CDD比對(duì)結(jié)果，共31077條EST序列獲得注釋。在這些獲得注釋序列中，6569條獲得了GO分類(lèi)信息；COG分析表明可被劃分為22類(lèi)。KEGG分析結(jié)果表明6281條ESTs可歸為291個(gè)KEGG途徑。搜尋EST序列的潛在SSR，得到1121個(gè)SSR。
　　（3）與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、毛果楊（Populus trichocarpa）

6、及小立碗蘚（Physcomitrella patens）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTX比對(duì)結(jié)果表明，日本落葉松（Larix leptolepis）和毛果楊有更多的同源序列。
　?。?）與PGI9.0及SGI5.0 EST并集數(shù)據(jù)庫(kù)、小立碗蘚Unigene、擬南芥及水稻Unigene并集、楊樹(shù)EST數(shù)據(jù)庫(kù)的TBLASTX比對(duì)表明，裸子植物和被子植物的基因信息有較大的差異，裸子植物的基因序列信息并不能完全從被子植物中得到注釋。