棗體細(xì)胞胚胎發(fā)生及倍性種質(zhì)創(chuàng)新.pdf

1、本文以冬棗組培苗葉片為外植體，利用固體培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)影響棗葉片體細(xì)胞胚胎發(fā)生的多種培養(yǎng)因子進(jìn)行了研究，并從組織細(xì)胞學(xué)方面對(duì)棗體細(xì)胞胚胎形態(tài)建成的機(jī)理進(jìn)行了初步研究；進(jìn)而利用所建立的葉片體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)體系進(jìn)行了多倍體誘導(dǎo)，并利用花藥培養(yǎng)和多細(xì)胞起源的不定芽再生體系等多種方法進(jìn)行了棗的倍性種質(zhì)創(chuàng)新研究。主要研究結(jié)果如下： 1．以冬棗離體葉片為外植體首次建立了冬棗葉片體細(xì)胞胚胎發(fā)生培養(yǎng)體系。冬棗離體葉片在MS+麥芽糖20g/L+瓊脂

2、3g/L+TDZ10.0mg/L的固體培養(yǎng)基上，可獲得初始愈傷組織，但愈傷組織在調(diào)整滲透壓、激素種類、光照條件及添加防褐化劑的情況下仍不能進(jìn)行繼代培養(yǎng)。但將葉片接種在MS+麥芽糖20g/L+瓊脂3g/L+TDZ10.0mg/L+AgNO<,3>2.0mg/L的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，不經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基即可一步實(shí)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)和胚狀體分化，分化率達(dá)84.9％。獲得的胚狀體在MS+蔗糖40g/L+瓊脂4g/L+CH500mg/L的無(wú)激素培養(yǎng)基上發(fā)育成

3、熟：在1/2MS+蔗糖20g/L+瓊脂4g/L+IBA2.0mg/L的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根獲得完整再生植株。 2．對(duì)冬棗離體葉片體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：(1)棗葉片體細(xì)胞胚以間接方式發(fā)生，即先由葉片脫分化產(chǎn)生愈傷組織，再?gòu)挠鷤M織上再分化形成胚狀體。(2)棗葉片體細(xì)胞胚以單細(xì)胞外起源發(fā)生，即葉片體細(xì)胞胚胎均起源于胚性愈傷組織中的單個(gè)胚性母細(xì)胞，且大多數(shù)胚性母細(xì)胞位于愈傷組織近表層的幾層細(xì)胞。(3)棗體胚發(fā)生過(guò)程中存

4、在生理隔離現(xiàn)象。(4)棗葉片體細(xì)胞胚發(fā)生存在不同步化現(xiàn)象。(5)棗葉片體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中存在三次淀粉粒積累高峰：胚性愈傷組織時(shí)期、球形胚期、魚(yú)雷胚期。 3．開(kāi)展棗花藥培養(yǎng)取得成功。棗花藥在MS+麥芽糖20g/L+2,4-D1.0mg/L的培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)出乳白色、塊狀初始愈傷組織，該類愈傷組織在2,4-D和TDZ作用下均不能進(jìn)行增殖和分化培養(yǎng)；棗花藥在MS+麥芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L的培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出淡黃色、顆粒狀初

5、始愈傷組織，該類愈傷組織在MS+麥芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖，保持淡黃色顆粒狀，在MS+麥芽糖20g/L+TDZ1.0mg/L+AgNO<,3>0.5mg/L固體培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。棗花藥胚狀體易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，在MS+蔗糖40g/L+瓊脂4.0g/L的培養(yǎng)基上，從三倍體贊皇大棗花藥胚狀體中獲得一株正常植株。經(jīng)葉片DNA含量和莖尖染色體數(shù)目鑒定，本試驗(yàn)首次獲得了贊皇大棗的2n花粉植株。經(jīng)組織細(xì)胞學(xué)觀察，棗

6、花藥體細(xì)胞胚也以間接方式單細(xì)胞外起源方式發(fā)生，胚狀體發(fā)生過(guò)程中同樣存在生理隔離和不同步化現(xiàn)象，且花藥胚狀體存在畸形胚。 4．利用葉片體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系一步獲得了冬棗純合四倍體。秋水仙素浸泡法對(duì)葉片傷害大，葉片無(wú)胚狀體發(fā)生；利用秋水仙素培養(yǎng)基混培法時(shí)，棗葉片有胚狀體發(fā)生，當(dāng)培養(yǎng)基秋水仙素濃度為15mg/L時(shí)，再生體胚發(fā)生變異，經(jīng)流式細(xì)胞儀葉片DNA含量和莖尖染色體數(shù)目檢測(cè)，變異植株為純合四倍體，染色體數(shù)為2n=2x=48。

7、 5．利用葉片直接再生不定芽體系獲得了冬棗二、四倍體嵌合體。棗葉片在MS+瓊脂3g/L+麥芽糖20g/L+BA1.0mg/L或TDZ1.0mg/L+AgN0O<,3>1.0mg/L的培養(yǎng)基上可直接再生不定芽，不定芽再生率分別為97.3％和90.1％。再生不定芽分別在MS+蔗糖40g/L+瓊脂4g/L+BA1.0mg/L+ IBA0.5mg8/L 和 1/2MS+蔗糖 20g/L+瓊脂4g/L+IBA1.0mg/L培養(yǎng)基上增殖和生根。利用

8、秋水仙素培養(yǎng)基混培法在葉片不定芽誘導(dǎo)時(shí)進(jìn)行誘變，當(dāng)培養(yǎng)基中秋水仙素濃度為15mg/L時(shí)，再生不定芽發(fā)生變異，經(jīng)流式細(xì)胞儀DNA含量檢測(cè)，變異植株為嵌合體。 6．開(kāi)展了利用田間枝干愈傷組織不定芽再生體系誘導(dǎo)多倍體研究，在TDZ4.0mg/L+AgNO<,3>2.0mg/L作用下，枝干截面形成層處可產(chǎn)生大量乳白色愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100％，不定芽誘導(dǎo)率為74.2％。但經(jīng)流式細(xì)胞儀DNA含量檢測(cè)，秋水仙素處理的田間愈傷組織不